Determinación de la actividad antioxidante total. Tesis: propiedades antioxidantes de la dihidroquercetina. El texto del trabajo científico sobre el tema "Método quimioluminiscente para determinar la capacidad antioxidante total en materiales vegetales medicinales".

19.09.2023

La invención se relaciona con la industria alimentaria y puede usarse para determinar la actividad antioxidante total. El método se lleva a cabo de la siguiente manera: el analito interactúa con el reactivo Fe (III) 0,006 M - o-fenantrolina 0,01 M. El ácido ascórbico (AA) reacciona con el mismo reactivo, que se añade en una proporción de 1:100. A continuación, incubar durante al menos 90 minutos y fotómetro a 510 ± 20 nm. Después de esto, se establece la dependencia de la magnitud de la señal analítica de la cantidad de sustancia y se calcula el valor del AOA total. El método presentado permite determinar de manera menos laboriosa y más confiable la actividad antioxidante total de los materiales vegetales y los productos alimenticios basados en ellos. 2 salario mosca, 1 enfermo, 5 mesas.

La invención se relaciona con la química analítica y puede usarse para determinar la actividad antioxidante total (AOA) de materiales vegetales y productos alimenticios basados en ella.

Existe un método coulométrico conocido para determinar el AOA total del té, basado en la interacción de extractos acuosos del producto con compuestos de bromo generados eléctricamente (I.F.Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov. Evaluación coulométrica de la capacidad antioxidante de los extractos de té con eléctricamente bromo generado // Journal of Analyst 2001. T.56 No. 6. P.627-629). La elección de compuestos de bromo electrogenerados como valorantes se debe a su capacidad para participar en diversas reacciones: radicales, redox, sustitución electrófila y adición en enlaces múltiples. Esto nos permite cubrir una amplia gama de compuestos del té biológicamente activos que tienen propiedades antioxidantes. Las desventajas de este método son la posibilidad de una reacción de bromación con sustancias que no son antioxidantes, y la expresión del valor resultante de AOA total en unidades de electricidad (kC/100 g), lo que dificulta la evaluación de los resultados obtenidos.

Existe un método voltamétrico conocido para determinar la actividad antioxidante total mediante el cambio relativo en la corriente de electrorreducción de oxígeno en el rango de potencial de 0,0 a -0,6 V (rel. sat. h.s.e.) en un electrodo de película de mercurio (Pat. 2224997, Rusia, IPC 7 G 01 N 33/01. Método voltamétrico para determinar la actividad total de antioxidantes / Korotkova E.I., Karbainov Yu.A - solicitud del 6 de junio de 2004; La desventaja de este método es que se producen reacciones electroquímicas secundarias, como resultado de lo cual disminuye la eficiencia de la determinación de antioxidantes, lo que conduce a una disminución en la confiabilidad de los resultados.

Existe un método conocido para monitorear el AOA total de agentes antioxidantes preventivos y terapéuticos mediante peroxidación lipídica a malonaldehído con detección espectrofotométrica o quimioluminiscente (Pat. 2182706, Rusia, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. Método para monitorear el actividad antioxidante de fondos antioxidantes preventivos / Pavlyuchenko I.A., Fedosov S.R - no 2001101389/14; En este caso, la actividad antioxidante es inversamente proporcional al nivel de productos de peroxidación lipídica. La desventaja de este método puede considerarse una gama limitada de objetos analizados, ya que en estas condiciones solo se determina un grupo de antioxidantes: los lípidos.

Existe un método conocido para determinar el AOA total de un extracto vegetal, que consiste en incubar el extracto con linetol y sulfato de hierro (II), iniciar una reacción de oxidación mediante irradiación UV y posterior interacción con ácido tiobarbitúrico en presencia de Triton X- 100 (Solicitud 97111917/13, Rusia, IPC 6 G 01 N 33/00. Método para determinar la actividad antioxidante general / Rogozhin V.V. - Solicitud 08/07/1997; Para la espectrofotometría se utiliza una mezcla de etanol y cloroformo en una proporción de 7:3. El valor AOA de un material biológico se determina mediante la relación entre la acumulación del producto de reacción: malondialdehído en una muestra que contiene un extracto y una muestra con un prooxidante. La desventaja de este método es la posibilidad de que se produzcan reacciones secundarias durante la irradiación UV, lo que reduce la fiabilidad de los resultados del análisis obtenidos.

Los métodos enumerados para determinar el AOA total tienen una serie de desventajas: alta intensidad de mano de obra, baja confiabilidad, el valor medido del AOA total no está relacionado ni es comparable con ninguna sustancia generalmente aceptada.

El análogo más cercano a la invención reivindicada es un método para determinar el AOA total de plantas medicinales midiendo la quimioluminiscencia que se produce durante la reacción con luminol en presencia del agente oxidante peróxido de hidrógeno (M.H. Navas, A.M. Khiminets, A.G. Azuero Determinación de la Capacidad reductora de tinturas de alpiste por quimioluminiscencia // Revista de química analítica 2004. T.59. Para cuantificar el AOA total, se comparó la capacidad reductora del extracto de materias primas medicinales y la actividad de un potente antioxidante: el ácido ascórbico en una cantidad de 25 a 110 μg. En comparación con los métodos enumerados, el prototipo utiliza peróxido de hidrógeno como agente oxidante, que interactúa con una amplia gama de antioxidantes, y el valor medido del AOA total del objeto se determina y expresa en relación con el ácido ascórbico, que es generalmente antioxidante aceptado, lo que permite obtener resultados confiables manteniendo otras desventajas. Las desventajas también incluyen la complejidad del equipo utilizado en el método.

El objetivo técnico de la invención reivindicada es desarrollar un método confiable y que requiera menos mano de obra para determinar la actividad antioxidante total de materiales vegetales y productos alimenticios basados en ella.

Para resolver el problema técnico, se propone interactuar el analito con el reactivo Fe(III) 0,006 M - o-fenantrolina 0,01 M y ácido ascórbico (AA) con el mismo reactivo, que se añade en una proporción de 1:100. , incubado durante al menos 90 minutos, fotométrico a 510±20 nm, seguido de establecer la dependencia del valor de la señal analítica de la cantidad de sustancia y calcular el valor del AOA total. En particular, el cálculo se puede realizar mediante la fórmula (I), derivada de la ecuación de correspondencia cuantitativa entre el objeto en estudio y el ácido ascórbico:

donde a, b son los coeficientes en la ecuación de regresión para la dependencia de la señal analítica de la cantidad de AC;

a", b" - coeficientes en la ecuación de regresión para la dependencia de la señal analítica de la cantidad del objeto en estudio;

x sol - masa del agente reductor (muestra) en estudio, mg.

El uso del reactivo propuesto en las condiciones especificadas hizo posible ampliar el rango lineal y reducir el límite inferior de las cantidades determinadas de ácido ascórbico. El conjunto de características esenciales propuesto permite determinar el AOA total de una amplia gama de materiales vegetales y productos alimenticios basados en ellos.

La ecuación de correspondencia cuantitativa conecta la dependencia de la señal analítica de la cantidad de ácido ascórbico y la dependencia de la señal analítica de la cantidad del objeto de prueba bajo la condición de igual actividad antioxidante.

Después de procesar los resultados de las mediciones fotométricas de la magnitud de la señal analítica utilizando el método de mínimos cuadrados (K. Derffel Estadística en química analítica. - M.: "Mir", 1994. P.164-169; A.K. Charykov Procesamiento matemático de la resultados del análisis químico - L.: Chemistry, 1984. pp. 137-144) estas dependencias se describieron mediante una función de regresión lineal: y=ax+b, donde a es el coeficiente de regresión, b es el término libre. El coeficiente a en la ecuación de regresión es igual a la tangente del ángulo de inclinación de la línea recta al eje x; coeficiente b: la distancia a lo largo del eje y desde el origen (0,0) hasta el primer punto (x 1, y 1).

Los coeficientes a y b se calculan mediante las fórmulas:

La ecuación de regresión para la dependencia de AC de la cantidad de ácido ascórbico en un momento dado tiene la forma:

y AK = a x AK (mg) + b,

ecuación de regresión para la dependencia de AC de la cantidad del objeto estudiado (agente reductor):

y VOST =a" x VOST (mg)+b",

donde en AK, en VOST es la densidad óptica de la solución fotométrica;

x AA (mg), x VOST (mg) - concentración de ácido ascórbico (agente reductor) en solución;

luego, igualando los valores de las funciones, obtenemos la fórmula (I) para calcular la actividad antioxidante del objeto en estudio en unidades de cantidad (mg) de ácido ascórbico.

El dibujo muestra la dependencia de la señal analítica de la cantidad de agente reductor.

La densidad óptica de las soluciones analizadas se midió utilizando un fotoelectrocolorímetro KFK-2MP.

Se sabe (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Wünsch Compuestos complejos en química analítica - M.: Mir, 1975. - 531 p.) que la o-fenantrolina forma con hierro un quelato soluble en agua ( II) color rojo anaranjado, que se caracteriza por un máximo de absorción en λ=512 nm. Por tanto, en el método propuesto, la fotometría se realiza a λ=510±20 nm.

La optimización de la composición del reactivo y su cantidad introducida en la reacción se realizó en base a los resultados del diseño experimental multifactorial utilizando el método del “cuadrado latino”, que consistió en cambiar todos los factores estudiados en cada experimento, y en cada nivel. de cada factor ocurre sólo una vez con diferentes niveles de otros factores. Esto permite aislar y evaluar el efecto causado por cada factor en estudio por separado.

Los factores fueron: la cantidad de Fe(III), o-fenantrolina y el volumen del reactivo introducido en la reacción. La combinación de factores debe proporcionar un amplio rango de linealidad de la señal analítica (AS) con suficiente sensibilidad, por un lado, y estabilidad del reactivo en el tiempo, por otro. Esto permitió identificar los siguientes niveles para cada factor:

cantidad de Fe(III): 0,003 M (A 1); 0,006 M (A2); 0,009 M (A 3);

cantidad de o-fenantrolina: 0,01 M (B 1); 0,02 M (B2); 0,03 M (B3);

volumen de reactivo: 0,5 ml (C 1); 1,0 ml (C2); 2,0 ml (C 3) (Tabla 1).

Para seleccionar la combinación óptima de niveles de factores, obtuvimos dependencias de calibración de AC de la cantidad de ácido ascórbico en el rango de 10 a 150 μg (que es necesario para confirmar la linealidad de la función), calculamos la ecuación de regresión de la dependencia obtenida. y luego calculó el valor de AC en una cantidad determinada (120 μg) de ácido ascórbico. Así, para cada composición de reactivo (factores A, B), se seleccionó el volumen (factor C) en el que el valor de CA es máximo. Esto nos permitió reducir el número de combinaciones consideradas a nueve (Tabla 2).

Comparando el total de AC para cada nivel, se identificaron los montos con valor máximo: ΣA 2 (0,991); ΣB1 (1,066); ΣC2 (1.361). Esto nos permitió concluir que la composición óptima del reactivo es: Fe(III) 0,006 M - o-fenantrolina 0,01 M con un volumen introducido en la reacción de 1,0 ml por 100 ml de solución.

En la concentración óptima del reactivo, estudiamos el cambio en la dependencia del AC de la concentración de ácido ascórbico y algunos agentes reductores comunes en los objetos naturales (tanino, rutina, quercetina) en diferentes tiempos de incubación de la mezcla de reacción (30, 60 , 90, 120 min). Se encontró que para todos los agentes reductores estudiados, la dependencia de AC de su contenido es lineal en el rango de 10-150 μg (ver dibujo) y el valor de AC depende del tiempo de incubación (Tabla 3).

En el dibujo se puede ver que el cambio en la AC bajo la influencia de la rutina es insignificante, los taninos se acercan y la quercetina supera la dependencia similar del ácido ascórbico. Al considerar el cambio en AS dependiendo del tiempo de incubación para todos los agentes reductores estudiados (Tabla 3), se encontró que la estabilización de la señal analítica en el tiempo se observa a partir de 90 minutos.

Tabla 3 Cambio en la CA de los agentes reductores a lo largo del tiempo.
Sustancia de prueba	m sustancia, mg/cm 3	Señal analítica
Sustancia de prueba	m sustancia, mg/cm 3	Tiempo de incubación de la mezcla de reacción, min.
30	60	90	120
ácido ascórbico	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tanino	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
rutina	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
quercetina	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Para demostrar el carácter sumativo del valor AOA determinado, se estudió el efecto del reactivo Fe (III) - o-fenantrolina en soluciones modelo, que incluían agentes reductores: tanino, rutina, quercetina y ácido ascórbico en diversas proporciones. La Tabla 4 presenta los resultados del análisis de mezclas de modelos.

Tabla 4 Resultados del análisis de mezclas de modelos (P=0,95; n=3)
Número de componentes en la mezcla.	AOA total, calculada, µgAC	AOA total, encontrada, µgAC
introducido	AOA total, calculada, µgAC	AOA total, encontrada, µgAC	en términos de AK
Alaska	Tanino	rutina	quercetina	Alaska	Tanino	rutina	quercetina
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

El cálculo del valor teórico del AOA total se realizó mediante ecuaciones de correspondencia cuantitativa que caracterizan la capacidad antioxidante del agente reductor estudiado en relación al ácido ascórbico, en condiciones de igual actividad antioxidante: .

El valor de AOA experimental (encontrado) se calculó utilizando la ecuación de regresión promediada para la dependencia de AC de la cantidad de ácido ascórbico. De los resultados presentados en la Tabla 4, queda claro que los valores de AOA obtenidos experimentalmente concuerdan satisfactoriamente con los calculados teóricamente.

Por tanto, el valor AOA determinado es un indicador resumido y la determinación de su valor mediante ecuaciones de correspondencia cuantitativa es correcta.

El método propuesto fue probado en muestras reales. Para determinar el AOA total de una muestra real o su extracto, se obtuvieron las dependencias de calibración de AC de la cantidad de analito y ácido ascórbico con un tiempo de incubación de la mezcla de reacción de al menos 90 minutos. El cálculo del AOA total se realizó según la fórmula (I) y se expresó en mg de ácido ascórbico por gramo del objeto de prueba (mgAA/g).

Para confirmar la exactitud del método propuesto, estas muestras se analizaron utilizando métodos conocidos, evaluando el contenido de ácido ascórbico (GOST 24556-89 Productos procesados de frutas y verduras. Métodos para determinar la vitamina C) y los agentes reductores predominantes: tanino en el té. (GOST 19885-74 Té. Métodos para determinar el contenido de tanino y cafeína), en escaramujos: la cantidad de ácidos orgánicos (GOST 1994-93 Escaramujos. Condiciones técnicas) (Tabla 5).

tesis

1.4 Métodos de investigación de antioxidantes.

La actividad antioxidante se clasifica: según los métodos de registro de la AOA manifestada (volumétrica, fotométrica, quimioluminiscente, fluorescente, electroquímica); por tipo de fuente de oxidación; por tipo de compuesto que se oxida; por el método de medición del compuesto oxidado.

Sin embargo, los métodos más conocidos para determinar la actividad antioxidante son:

1 TEAC (capacidad antioxidante equivalente a trolox): el método se basa en la siguiente reacción:

Metmioglobina + H 2 O 2 > Ferrylglobina + ABTS > ABTS * + AO.

El método de equivalentes de Trolox (TEAC) se basa en la capacidad de los antioxidantes para reducir los cationes radicales 2,2-azinobis (ABTS) y así inhibir la absorción en la región de longitud de onda larga del espectro (600 nm). Una desventaja importante del método es la reacción en dos pasos para producir el radical. Esto alarga el tiempo de análisis y puede aumentar la dispersión de los resultados, a pesar de que para el análisis se utiliza un conjunto estandarizado de reactivos.

2 FRAP (poder antioxidante reductor férrico): el método se basa en la siguiente reacción:

Fe(III)-Tripiriditriazina+AO>Fe(II)-Tripiridiltriazina.

Capacidad reductora/antioxidante del hierro (FRAP). La reacción utilizada aquí es la reducción de Fe (III) - tripiridiltriazina a Fe (II) - tripiridiltriazina. Sin embargo, este método no puede detectar algunos antioxidantes, como el glutatión. Este método permite la determinación directa de antioxidantes de bajo peso molecular. A pH bajo, la reducción del complejo Fe(III)-tripiridiltriazina al complejo Fe(II) va acompañada de la aparición de un color azul intenso. Las mediciones se basan en la capacidad de los antioxidantes para suprimir el efecto oxidativo de las especies de reacción generadas en la mezcla de reacción. Este método es sencillo, rápido y económico de implementar.

3 ORAC (capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno): el método se basa en la siguiente reacción:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Determinación de la capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno (ORAC). En este método se registra la fluorescencia de un sustrato (ficoeritrina o fluoresceína), que surge como resultado de su interacción con ROS. Si la muestra de prueba contiene antioxidantes, se observa una disminución de la fluorescencia en comparación con la muestra de control. Este método fue desarrollado originalmente por el Dr. Guohua Kao en el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento en 1992. En 1996, el Dr. Kao se asoció con el Dr. Ronald Pryer en un grupo conjunto en el Centro de Investigación sobre el Envejecimiento del USDA, donde se desarrolló el método semiautomático. creado.

4 TRAP (parámetro antioxidante atrapador de radicales totales): el método se basa en la siguiente reacción:

AAPH+AO>AAPH* + PL (FE).

Este método aprovecha la capacidad de los antioxidantes para interactuar con el radical peroxilo diclorhidrato de 2,2-azobis(2-amidinopropano) (AAPH). Las modificaciones de TRAP consisten en métodos para registrar la señal analítica. Muy a menudo, en la etapa final del análisis, el radical peroxi AAPH interactúa con un sustrato luminiscente (luminol), fluorescente (diacetato de diclorofluoresceína, DCFH-DA) u otro sustrato ópticamente activo.

El derivado soluble en agua de la vitamina E Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxi) se utiliza como estándar para los métodos TEAC, ORAC y TRAP.

Recientemente, ha aumentado el interés en el uso de métodos electroquímicos para evaluar la actividad antioxidante. Estos métodos tienen alta sensibilidad y análisis rápido.

La evaluación de la actividad antioxidante de algunos productos alimenticios se realiza mediante el método de potenciometría, basado en el aprovechamiento de la propiedad de las sustancias antioxidantes de participar en reacciones redox debidas a los grupos enol (-OH) y sulfhidrilo (-SH).

La determinación de las propiedades antioxidantes de las soluciones se basa en la interacción química de los antioxidantes con el sistema mediador, lo que conduce a un cambio en su potencial redox. Una celda electroquímica es un recipiente que contiene una solución tampón de fosfato K-Na, un sistema mediador Fe(III)/Fe(II) y un electrodo complejo antes de medir el potencial redox. La actividad antioxidante se evalúa en g-eq/l.

El método amperométrico para determinar la actividad antioxidante se basa en medir la corriente eléctrica que se produce durante la oxidación de la sustancia problema en la superficie del electrodo de trabajo, que se encuentra bajo un cierto potencial. La sensibilidad del método amperométrico está determinada tanto por la naturaleza del electrodo de trabajo como por el potencial que se le aplica. El límite de detección del detector amperométrico de polifenoles y flavonoides está en el nivel de nanopicogramos, en concentraciones tan bajas existe una menor probabilidad de influencia mutua de diferentes antioxidantes cuando están presentes juntos, en particular la manifestación del fenómeno de sinergia; . Las desventajas del método incluyen su especificidad: en estas condiciones, no se pueden analizar los antioxidantes que a su vez se oxidan o reducen en la región de los potenciales de electrorreducción del oxígeno. Las ventajas del método incluyen su velocidad, próstata y sensibilidad.

Método de coulometría galvanostática que utiliza oxidantes generados eléctricamente: el método es aplicable para el análisis de antioxidantes liposolubles.

Se han desarrollado varios métodos para la determinación del ácido ascórbico:

método amperométrico utilizando un electrodo de aluminio modificado con una película de hexacianoferrato de níquel (II) por simple inmersión en una solución;

un método para la determinación de prueba visual y espectrofotométrica en fase sólida de ácido ascórbico utilizando xerogel de ácido silícico modificado con reactivo de Wawele y cobre (II) como polvo indicador;

La determinación quimioluminiscente del ácido ascórbico se puede realizar mediante el método de inyección de flujo utilizando la reacción quimioluminiscente de rodamina B con cerio (IV) en un medio de ácido sulfúrico.

determinación de ácido ascórbico en el rango de 10 -8 -10 -3 g/cm 3 mediante voltamperometría anódica en medios acuosos y acuosos-orgánicos.

El más común es el método FRAP, ya que es rápido y muy sensible. En las últimas décadas, se ha desarrollado una gran variedad de métodos para determinar la actividad antioxidante utilizando el método FRAP (Tabla 1).

Cuadro 1 Desarrollo del método FRAP y su aplicación para determinar la actividad antioxidante de diversos objetos

	Objetos de análisis	Notas
	Plasma sanguíneo	t=4min. Se estudiaron la estequiometría y la aditividad de la reacción.
	té, vino	Determinación de AOA debido a polifenoles.
		Se compararon los valores de AOA de diferentes variedades de té.
Pulido, Bravo, Saura Calixto.	Soluciones modelo	t=30min. Se reveló la influencia de un disolvente no acuoso.
	Plantas
	sangre, tejido	Método PIA. Se ha probado la influencia de sustancias extrañas.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.	Soluciones modelo	Se estudió la sensibilidad de determinación de diferentes AO en función de su estructura y potencial redox.
Katalínico, Milos,	Vinos varios
Temerdashev, Tsyupko y otros.	Mezclas de modelos
Loginova, Konovalova	Medicamentos Medicamentos	Método de prueba
Temerdashev, Tsyupko y otros.	Vinos tintos secos	Correlación del AOA con otros indicadores de calidad del vino
Continuación de la Tabla 1
	Mezclas de modelos	Se estudió la sensibilidad de la determinación de diferentes AO.
Vershinin, Vlasova, Tsyupko	Mezclas de modelos	Se encontró que la señal no era aditiva cuando faltaba agente oxidante.
Anisimovich, Deineka y otros.	Soluciones modelo	Se han propuesto parámetros cinéticos para evaluar la AOA.

Notas: designado convencionalmente: análisis de inyección de flujo FIA, TPTZ-tripiridiltriazina, DIP-2,2,-dipiridilo, PHEN-o-fenantrolina, ácido DPA-piridinadicarboxílico, FZ-ferrozina, ácido ascórbico AA, CT-catecol, t -tiempo de exposición, min.

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], sin embargo, la definición de antioxidantes como compuestos químicos no da una imagen completa de las propiedades protectoras del objeto en estudio: están determinadas no solo por la cantidad de un antioxidante en particular, sino también por la actividad de cada uno de ellos. La actividad antioxidante, o actividad antioxidante, AOA, es la constante de velocidad de reacción de un antioxidante con un radical libre (kInH). El método de quimioluminiscencia (CL) permite determinar la cantidad total de radicales que se unen a los antioxidantes en una muestra (capacidad antioxidante total, TAU), y cuando se utiliza el método de modelado matemático de la cinética de CL, también la velocidad de formación y reacción de radicales con antioxidantes, es decir, AOA [, ,].

La modificación más común del método de quimioluminiscencia para determinar la capacidad antioxidante total se basa en el uso de luminol como activador de quimioluminiscencia [, , ,]. Se coloca una muestra en una cubeta de quimioluminómetro con la adición de luminol, peróxido de hidrógeno y un compuesto capaz de formar radicales como resultado de una descomposición espontánea (termólisis), por ejemplo diclorhidrato de 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) (ABAP). ): ABAP → 2R. En presencia de oxígeno molecular, el radical alquilo R forma el radical peroxilo ROO: R + O 2 → ROO. A continuación, el radical peroxilo oxida la sonda quimioluminiscente luminol (LH 2) y se forma el radical luminol (LH): ROO + LH 2 → ROOH + LH. A partir de la LH, mediante la formación de sustancias intermedias (hidroperóxido de luminol y endoperóxido de luminol), se forma en estado excitado electrónicamente una molécula del producto final de la oxidación del luminol, el ácido aminoftálico, que emite un fotón, y como resultado se observa quimioluminiscencia. . La intensidad de CL es proporcional a la tasa de producción de fotones y, a su vez, es proporcional a la concentración estacionaria de LH en el sistema. Al interactuar con los radicales, los antioxidantes interrumpen la cadena de transformaciones descrita e impiden la formación de un fotón.

Los compuestos susceptibles a la termólisis no son la única fuente posible de radicales cuando se analiza la capacidad antioxidante de una muestra mediante el método quimioluminiscente. Las alternativas son los sistemas peroxidasa de rábano picante-peróxido de hidrógeno [, ], hemina-peróxido de hidrógeno, citocromo Con–cardiolipina–peróxido de hidrógeno, etc. El esquema de reacción para la oxidación del luminol por peroxidasas se considera en el trabajo de Cormier et al. .

Las curvas cinéticas de CL para estos sistemas reflejan dos etapas de la reacción: la etapa de aumento de la intensidad de CL y la etapa de meseta o disminución gradual de la luminiscencia, cuando la intensidad de CL es constante o disminuye lentamente. El trabajo describe dos enfoques para medir la capacidad antioxidante total que tienen en cuenta esta característica de las curvas. El método TRAP (Potencial Antioxidante Reactivo Total) se basa en medir el período de latencia de CL τ y se pueden utilizar para determinar antioxidantes como Trolox o ácido ascórbico: se caracterizan por una alta velocidad de reacción constante con los radicales y por esta razón se les puede llamar antioxidantes fuertes. Durante el período latente se produce su completa oxidación. El método TAR (Reactividad Antioxidante Total) mide el grado de extinción de la quimioluminiscencia q en la meseta o máximo de la curva de quimioluminiscencia: fórmula, donde I es la intensidad de la quimioluminiscencia sin antioxidante, y I 1 es la intensidad de CL en presencia de un antioxidante. Este método se utiliza si el sistema contiene predominantemente antioxidantes débiles con constantes de velocidad de interacción con radicales bajas, mucho más bajas en comparación con la constante del luminol.

El efecto de los antioxidantes se caracteriza no solo por indicadores. τ Y q. Como se desprende de los trabajos [,], el efecto de antioxidantes como el ácido úrico en el sistema hemina-H 2 O 2 -luminol o el tocoferol, la rutina y la quercetina en el sistema citocromo Con–cardiolipina–H 2 O 2 –luminol, caracterizado por un cambio en la tasa máxima de aumento de CL ( vmáx). Como muestran los resultados del modelado matemático de la cinética, los valores de las constantes de velocidad de interacción de estos antioxidantes con radicales están cerca del valor de la constante de luminol, por lo que dichos antioxidantes pueden denominarse antioxidantes de fuerza media.

Si el material en estudio, en particular las materias primas vegetales, contuviera solo un tipo de antioxidantes, entonces su contenido podría caracterizarse por uno de los tres indicadores enumerados anteriormente ( τ , q o vmáx). Pero los materiales vegetales contienen una mezcla de antioxidantes de distintas concentraciones. Para resolver este problema, algunos autores [ , , , ] utilizaron el cambio en la suma luminosa de la quimioluminiscencia durante un tiempo determinado ∆S, calculado mediante la fórmula , donde ∆ S 0 y ∆ S S- CL sumas de luz para un tiempo determinado t en las muestras de control y de prueba, respectivamente. El tiempo debe ser suficiente para la oxidación de todos los antioxidantes en el sistema, es decir, para que la curva CL de la muestra de prueba alcance el nivel de la curva CL de la muestra de control. Esto último supone que los investigadores no sólo deben registrar la suma luminosa del resplandor, sino también la curva cinética de CL durante un tiempo suficientemente largo, lo que no siempre se hace.

Dado que todos los indicadores medidos dependen del dispositivo y las condiciones de medición, el efecto antioxidante de la sustancia en el sistema en estudio generalmente se compara con el efecto de un antioxidante tomado como estándar, por ejemplo Trolox [,].

Muchos autores han utilizado el sistema peroxidasa de rábano picante-peróxido de hidrógeno para analizar la capacidad antioxidante total de los materiales vegetales. En los trabajos [,] para estimar la cantidad de antioxidantes en las muestras se utilizó el período de latencia de CL (método TRAP), y en los trabajos [, ,] - el área bajo la curva de desarrollo de CL. Sin embargo, los trabajos enumerados no proporcionan una justificación clara para la elección de uno u otro parámetro para evaluar la OUA.

El objetivo del estudio fue determinar cómo la proporción de diferentes tipos de antioxidantes afecta al TOA y modificar el método de quimioluminiscencia de tal manera que se pueda determinar con mayor precisión el TOA en materiales vegetales. Para ello, nos planteamos varias tareas. Primero, compare la cinética de CL de los objetos estudiados con la cinética de los antioxidantes estándar de tres tipos (fuerte, medio y débil) para comprender qué tipo de antioxidantes hacen la principal contribución a la OAU de los objetos estudiados. En segundo lugar, calcular la OAE de los objetos en estudio midiendo la disminución de la suma de luz CL bajo la influencia de estos objetos en comparación con el efecto del antioxidante que aporta el mayor aporte a la OAE.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los objetos del estudio fueron muestras industriales de espino, serbal y escaramujo producidos por JSC Krasnogorskleksredstva (Rusia), así como frutos de frambuesa recolectados por los autores en la región de Moscú en condiciones de crecimiento natural y secados a una temperatura de 60 a 80 °. C hasta que dejaran de soltar jugo y deformarse al presionarlos.

Los reactivos para analizar la capacidad antioxidante mediante el método quimioluminiscente fueron: KH 2 PO 4, solución tampón 20 mM (pH 7,4); peroxidasa de raíces de rábano picante (actividad 112 unidades/mg, M = 44.173,9), solución acuosa 1 mM; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindiona, hidrazida del ácido 3-aminoftálico, M = 177,11), solución acuosa 1 mM; peróxido de hidrógeno (H 2 O 2, M = 34,01), solución acuosa 1 mM; Soluciones de antioxidantes (ácido ascórbico, quercetina, tocoferol). Todos los reactivos son fabricados por Sigma Aldrich (EE. UU.).

Se prepararon decocciones de frutos de espino, serbal y rosa mosqueta y una infusión de frutos de frambuesa según los métodos de la Farmacopea Estatal de la URSS, establecidos en el artículo general de la farmacopea "Infusiones y decocciones".

La determinación de la capacidad antioxidante total se llevó a cabo registrando quimioluminiscencia en un quimioluminómetro Lum-100 (DISoft, Rusia) utilizando el software PowerGraph 3.3. Para determinar la OAE en materiales vegetales se utilizan 40 μl de luminol a una concentración de 1 mM, 40 μl de peroxidasa de rábano picante a una concentración de 0,1 μM, de 10 a 50 μl de decocción o infusión (según la concentración) y tampón fosfato en el La cantidad requerida se colocó en la cubeta del dispositivo para llevar el volumen total de la muestra a 1 ml. Se instaló la cubeta en el dispositivo y se registró CL, observando la señal de fondo. Después de 48 s de registrar la señal de fondo, se agregaron a la cubeta 100 µl de H2O2 a una concentración de 1 mM y el registro de CL se continuó durante 10 minutos. Se prepararon cuatro muestras con diferentes concentraciones de cada objeto vegetal. También se registró CL para soluciones de ácido ascórbico, quercetina y tocoferol en cinco concentraciones diferentes para cada antioxidante. Posteriormente, la OAU de las muestras de decocciones e infusiones se recalculó a quercetina.

Las concentraciones de luminol, peroxidasa de rábano picante y peróxido de hidrógeno se seleccionaron de manera que se determinara la capacidad antioxidante de extractos acuosos de materiales de plantas medicinales en un tiempo aceptable (no más de 10 min). Durante este tiempo, las curvas de quimioluminiscencia de los antioxidantes ascorbato y el flavonoide quercetina (los principales antioxidantes de los materiales vegetales) alcanzaron una meseta, lo que indica la destrucción completa de los antioxidantes en el sistema. Las diluciones de las muestras estudiadas y las concentraciones de soluciones de antioxidantes estándar (indicadas en las leyendas de las figuras) se seleccionaron de tal manera que todas las curvas cinéticas de CL se midieron con la misma sensibilidad del dispositivo.

La capacidad antioxidante se calculó a partir del cambio de área (∆ S) bajo la curva cinética de quimioluminiscencia (suma de luz) al agregar una sustancia que contiene un antioxidante. Para ello calculamos S 0 para un sistema sin antioxidante y le restamos el área S S, caracterizando el sistema al que se añadió el antioxidante. Valor ∆ S Depende de la sensibilidad del quimioluminómetro y de las condiciones de medición. Relación ∆ S/CV(Dónde do- concentración del material biológico en estudio en la cubeta, g/l, y V- volumen de la cubeta, l) expresa la capacidad antioxidante de 1 g del material en estudio, es decir, materias primas vegetales.

La capacidad antioxidante ∆ se calculó de manera similar S A una solución de un antioxidante estándar, por ejemplo quercetina, colocada en el mismo volumen de la mezcla de reacción. Relación ∆ S A/C A V(Dónde C A- concentración en peso del antioxidante en la cubeta, g/l) expresa la capacidad antioxidante de 1 g de antioxidante.

Para cada uno de los antioxidantes estándar, se registró la señal de soluciones de varias concentraciones para garantizar que los cálculos estuvieran dentro de una relación lineal y que los resultados obtenidos fueran reproducibles. De hecho, se obtuvo una dependencia lineal (∆ S A = k A C A) señal de la concentración a partir de la cual se calculó el coeficiente estequiométrico k un. Según el criterio de Fisher, los valores obtenidos para los antioxidantes estándar k un estadísticamente significativo con una probabilidad de 0,975. A continuación, se registró la señal de cuatro concentraciones para cada una de las cuatro muestras de plantas, y para todas las muestras se obtuvo una dependencia lineal de la señal con la concentración (∆ S = k·C), a partir del cual se calculó el coeficiente estequiométrico k. Con una probabilidad de 0,975 (prueba de Fisher), los valores de k obtenidos para las muestras de plantas son estadísticamente significativos. La capacidad antioxidante total del material vegetal en términos de masa del antioxidante estándar (mg%) se encontró utilizando la fórmula.

Los valores se presentaron como media aritmética ± desviación estándar (M ± δ) en p

RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN

Estudio de la cinética de la quimioluminiscencia en presencia de ascorbato de sodio (Fig. 1. Efecto del ascorbato de sodio sobre la cinética de la quimioluminiscencia" data-note="Concentraciones de los componentes del sistema: luminol - 40 µM, peroxidasa de rábano picante - 4 nM, peróxido de hidrógeno - 100 µM Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM de ascorbato de sodio.">Fig. 1) mostró que para esto el antioxidante se caracteriza por un período de latencia en el que la CL es casi completamente suprimido. Su duración es proporcional a la cantidad de antioxidante en el sistema. Al mismo tiempo, ni la pendiente de las curvas de CL ni la intensidad de CL en la meseta cambian. Esto se explica por el hecho de que el ácido ascórbico es un fuerte. Antioxidante que intercepta todos los radicales formados en el sistema, incluidos los radicales luminol, y el CL no se desarrolla hasta que se oxida todo el ascorbato.

Otros investigadores también han demostrado que los resultados del análisis químico y el valor TAU determinado mediante el método quimioluminiscente a menudo no coinciden. En el trabajo, la capacidad antioxidante total determinada en el sistema peroxidasa-luminol-peróxido de hidrógeno se correlacionó con el contenido de compuestos triterpénicos. Sin embargo, en el trabajo de los mismos autores, cuyo objeto de estudio fue otra planta, no observaron correlación de la OAE con el contenido de ningún grupo de sustancias, incluidos los flavonoides.

Estas discrepancias están asociadas con al menos tres factores. En primer lugar, es importante la actividad de los antioxidantes, es decir, la velocidad de su interacción con los radicales, que es diferente para los distintos antioxidantes incluidos en la muestra de la planta. Según Izmailov, las constantes de velocidad de las reacciones correspondientes para mexidol, tocoferol y quercetina se correlacionan en 0,04: 2: 60. En segundo lugar, cada molécula de antioxidante, al entrar en una reacción química, puede interceptar un número diferente de radicales. Según el trabajo, la quercetina, los ácidos úrico y ascórbico interceptaron 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 y 0,5 ± 0,2 radicales por molécula de antioxidante reaccionada, respectivamente (se utilizó el sistema hemina-H 2 O 2 -luminol). En tercer lugar, los resultados del estudio podrían verse influidos por la presencia de actividad peroxidasa en las propias muestras de plantas, como en el trabajo, así como por la presencia de calcio en las muestras, que, como se muestra en el trabajo, es capaz de aumentar. la actividad de la peroxidasa de rábano picante en determinadas condiciones. Esto suele provocar una mayor intensidad de CL en la meseta que en las curvas de control, lo que, sin embargo, no observamos.

El primer factor limita drásticamente el uso de un parámetro como el cambio en la suma de luz, ya que el tiempo para medir la quimioluminiscencia debe ser mayor que el tiempo para el consumo de todos los antioxidantes en la muestra de prueba. La aparición de este momento sólo puede juzgarse midiendo la cinética de la quimioluminiscencia. Además, la contribución de los antioxidantes débiles al TAU se subestima considerablemente, ya que el tiempo para su oxidación completa es muchas veces mayor que la duración aceptable de la medición (10 a 20 minutos).

El coeficiente estequiométrico del antioxidante es aún más importante. Número de radicales norte interceptado por él es igual a , donde ρ es el coeficiente estequiométrico, y ∆ metro- cambio en la concentración del antioxidante durante la medición, en nuestro caso - la concentración inicial de la sustancia problema en la muestra problema.

La diferencia en la suma luminosa de luminiscencia en ausencia de un antioxidante y en su presencia es proporcional. norte. El número total de radicales interceptados es , donde ρ yo es el coeficiente estequiométrico de un antioxidante específico, y yo yo- su concentración durante la medición. El número total de radicales interceptados obviamente no es igual a la cantidad total de antioxidantes, ya que los coeficientes ρ yo no sólo no son iguales a la unidad, sino que también difieren significativamente para los diferentes antioxidantes.

Magnitud norte es proporcional a la diferencia en sumas de luz medidas durante un tiempo determinado entre una muestra que contiene un antioxidante y una muestra de control que no contiene antioxidantes: S = kn, Dónde k- coeficiente, constante en las mismas condiciones de medición.

El método comentado en el artículo nos permite determinar la capacidad antioxidante total, mientras que el análisis químico nos permite determinar el contenido total de antioxidantes en el producto. Por tanto, el método de quimioluminiscencia parece ser más informativo que los análisis químicos.

Las condiciones que seleccionamos para evaluar la capacidad antioxidante total de las materias primas vegetales registrando la cinética de quimioluminiscencia en un sistema que consiste en peroxidasa de rábano picante, peróxido de hidrógeno y luminol (concentraciones de componentes: 4 nM, 100 µM y 40 µM, respectivamente; fosfato 20 mM tampón, pH 7,4), aseguró la oxidación de antioxidantes fuertes (ácido ascórbico) y antioxidantes de potencia media (quercetina) en 10 minutos. Esta duración de la medición es cómoda y garantiza la calidad de medición requerida.

El análisis de la cinética de la quimioluminiscencia mostró que en los objetos estudiados (decocciones de frutos de serbal, escaramujo, espino e infusión de frutos de frambuesa) los principales antioxidantes son antioxidantes de potencia media, incluidos flavonoides, y de potencia débil (tocoferol, etc.). A partir de la disminución de la suma de luz de quimioluminiscencia, se calculó la capacidad antioxidante total de los objetos estudiados. La comparación de los valores de TAU obtenidos con los resultados del análisis químico mostró que los productos que contienen la misma cantidad de antioxidantes en diferentes proporciones pueden diferir en su capacidad para proteger eficazmente al cuerpo de los efectos nocivos de los radicales libres. La técnica descrita es prometedora para el estudio de objetos vegetales que contienen una mezcla de varios antioxidantes. Al mismo tiempo, se caracteriza por la sencillez y el bajo coste de la investigación. La combinación de la medición de la cinética de quimioluminiscencia con el modelado matemático de reacciones permitirá no solo automatizar el proceso de determinación de TAU, sino también determinar la contribución de grupos individuales de antioxidantes al indicador.

Antioxidantes (AO)- sustancias que previenen la oxidación.

En un organismo vivo, el principal factor de oxidación es la formación de radicales libres, por lo que la acción de los antioxidantes en los sistemas biológicos se considera principalmente desde el punto de vista de prevenir la oxidación de sustancias orgánicas por los radicales libres.

Actualmente, existe una gran cantidad de métodos diferentes para determinar los antioxidantes: fotométricos, químicos, electroquímicos, etc. Sin embargo, muchos de ellos tienen importantes inconvenientes que dificultan la comprensión y el uso posterior de los resultados obtenidos por estos métodos.
Las desventajas más comunes incluyen las siguientes:

Para medir el efecto antioxidante se utilizan condiciones artificiales o no características de los sistemas biológicos.

Por ejemplo, en lugar de reacciones biológicas de radicales libres, se utilizan reacciones redox puramente químicas o se mide la capacidad de una sustancia para donar/aceptar electrones cuando se expone a una corriente eléctrica. Los resultados de las mediciones obtenidos en tales condiciones no nos permiten decir si la sustancia en estudio mostrará el mismo efecto "antioxidante" en el cuerpo.

La determinación del efecto antioxidante se lleva a cabo midiendo la cantidad de productos de oxidación acumulados (marcadores de oxidación). De esta manera, es posible determinar la cantidad de antioxidante en la muestra de prueba, pero se pierde información muy importante sobre la actividad del antioxidante.
Una ventaja significativa de este enfoque es la posibilidad de utilizar varios sistemas químicos para la generación de radicales libres, lo que permite determinar en mayor medida la especificidad de los antioxidantes y la localización de su acción.
Medición de las características cuantitativas y cualitativas de los antioxidantes.- El método quimioluminiscente permite caracterizar cualquier compuesto que tenga efecto antioxidante mediante dos indicadores independientes:
- Capacidad antioxidante (AOE)- la cantidad total de radicales libres que pueden neutralizar un compuesto contenido en una muestra de un volumen determinado.
- Actividad antioxidante (AOA)- la tasa de neutralización de los radicales libres, es decir el número de radicales neutralizados por unidad de tiempo.

Por ejemplo, en lugar de reacciones biológicas de radicales libres, se utilizan reacciones redox puramente químicas o se mide la capacidad de una sustancia para donar/aceptar electrones cuando se expone a una corriente eléctrica. da una comprensión importante de que el efecto de los antioxidantes debe evaluarse mediante dos indicadores: cuantitativo (AOE) y cualitativo (AOA).
La siguiente figura demuestra esta situación:

El efecto de diferentes antioxidantes sobre la quimioluminiscencia.
(los números al lado de los gráficos indican la concentración de antioxidante):
a la izquierda hay un antioxidante "fuerte", a la derecha hay un antioxidante "débil".

Los antioxidantes difieren significativamente en su actividad. Hay antioxidantes "fuertes", es decir. Antioxidantes altamente activos que inhiben los radicales libres a un ritmo elevado y suprimen por completo la quimioluminiscencia. Estos antioxidantes tienen un efecto máximo incluso en concentraciones bajas y se consumen rápidamente.

Por otro lado, existen antioxidantes “débiles”, es decir. Antioxidantes de baja potencia que inhiben los radicales libres a un ritmo bajo y solo inhiben parcialmente la quimioluminiscencia.

Estos antioxidantes tienen un efecto significativo sólo en altas concentraciones, pero al mismo tiempo se consumen lentamente y actúan durante mucho tiempo.
El método quimioluminiscente se puede utilizar para determinar indicadores antioxidantes:
fluidos biológicos (plasma, saliva, orina);
medicamentos farmacológicos y suplementos dietéticos;
bebidas y aditivos alimentarios;

cosméticos y productos para el cuidado;

etc.
Para implementar el método quimioluminiscente para la determinación de antioxidantes, se recomienda utilizar el siguiente equipo:

Quimioluminómetro Lum-100: proporciona termostatización y registro de quimioluminiscencia de 1 muestra.

Quimioluminómetro Lum-1200: proporciona control de temperatura y registro simultáneo de quimioluminiscencia para hasta 12 muestras. Palabras clave radical libre / capacidad antioxidante total / quimioluminiscencia/ luminol / radical libre / antioxidante / actividad antioxidante / capacidad antioxidante total / quimioluminiscencia / luminol

Anotación artículo científico sobre ciencias químicas, autor del trabajo científico - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu Izmailov, Yu.

Los materiales vegetales medicinales son una de las fuentes de antioxidantes para el cuerpo humano. Entre los métodos para determinar el contenido de antioxidantes en objetos vegetales, está muy extendido el método de análisis de quimioluminiscencia. En este trabajo se utilizó para estimar capacidad antioxidante total(OAE) decocciones de frutos de serbal, rosa mosqueta y espino albar e infusión de frutos de frambuesa. La cinética se registró en el experimento. quimioluminiscencia en un sistema compuesto por peroxidasa de rábano picante, peróxido de hidrógeno y luminol. Las concentraciones y el volumen de los componentes del sistema en la muestra se seleccionaron de modo que los antioxidantes fuertes (ácido ascórbico) y los antioxidantes moderados (quercetina) se oxidaran completamente durante el tiempo de medición (10 min). Se propone y justifica un método para calcular la OAE basado en cambios en la suma ligera. quimioluminiscencia en presencia de muestras de plantas. Análisis cinético quimioluminiscencia demostró que en los objetos estudiados predominan los antioxidantes de potencia media, incluidos los flavonoides, y los antioxidantes débiles (tocoferol, etc.). Una comparación de los valores de OAE calculados para los objetos estudiados y los datos de su análisis químico mostró que los productos que contienen la misma cantidad de antioxidantes con diferentes proporciones según el tipo pueden diferir en su capacidad para proteger al cuerpo de los efectos nocivos de los radicales libres. . La técnica descrita es prometedora para el estudio de objetos vegetales que contienen una mezcla de antioxidantes de varios tipos.

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Determinación quimioluminiscente de la capacidad antioxidante total en material vegetal medicinal.

El material vegetal medicinal es una de las fuentes de antioxidantes para el cuerpo humano. El análisis de quimioluminiscencia es uno de los métodos comunes para determinar el contenido de antioxidantes en materiales vegetales. En nuestro trabajo, se utilizó el análisis de quimioluminiscencia para determinar la capacidad antioxidante total (TAC) de decocciones de frutos de serbal, rosa y espino, así como de infusión de frutos de frambuesa. Los experimentos establecieron la cinética de la quimioluminiscencia de un sistema compuesto por peroxidasa de rábano picante, peróxido de hidrógeno y luminol. Las concentraciones y volúmenes de los componentes del sistema se eligieron de manera que los antioxidantes fuertes (ácido ascórbico) y los antioxidantes de fuerza media (quercetina) se oxidaran completamente durante la medición (10 minutos). Se propuso y justificó un método para calcular el TAC basado en cambios en la suma de luz de quimioluminiscencia en presencia de muestras de plantas. El análisis de la cinética de quimioluminiscencia mostró que en los objetos estudiados predominan los antioxidantes de fuerza media, incluidos los flavonoides y los antioxidantes débiles (tocoferol y otros). La comparación de los valores de TAC calculados para los objetos en estudio y los datos de sus análisis químicos mostró que los productos que contienen la misma cantidad de antioxidantes con diferentes proporciones de antioxidantes por tipo pueden variar en su capacidad para proteger el cuerpo contra los efectos nocivos de los radicales libres. . La técnica descrita es prometedora para el estudio de objetos vegetales que contienen una mezcla de diferentes tipos de antioxidantes.

Texto del trabajo científico. sobre el tema “Método quimioluminiscente para determinar la capacidad antioxidante total en materiales vegetales medicinales”

Método quimioluminiscente para determinar la capacidad antioxidante total en materiales vegetales medicinales.

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu Izmailov1, Yu.

1Departamento de Biofísica Médica, Facultad de Medicina Fundamental, Universidad Estatal M.V. Lomonosov de Moscú, Moscú

2 Departamento de Farmacognosia, Facultad de Farmacia,

Primera Universidad Médica Estatal de Moscú que lleva el nombre de I.M. Sechenov, Moscú

Los materiales vegetales medicinales son una de las fuentes de antioxidantes para el cuerpo humano. Entre los métodos para determinar el contenido de antioxidantes en objetos vegetales, está muy extendido el método de análisis de quimioluminiscencia. En este trabajo se utilizó para evaluar la capacidad antioxidante total (TAC) de decocciones de frutos de serbal, rosa mosqueta y espino e infusión de frutos de frambuesa. En el experimento, se registró la cinética de la quimioluminiscencia en un sistema compuesto por peroxidasa de rábano picante, peróxido de hidrógeno y luminol. Las concentraciones y el volumen de los componentes del sistema en la muestra se seleccionaron de modo que los antioxidantes fuertes (ácido ascórbico) y los antioxidantes moderados (quercetina) se oxidaran completamente durante el tiempo de medición (10 min). Se ha propuesto y justificado un método para calcular la OAE basado en cambios en la suma luminosa de quimioluminiscencia en presencia de muestras de plantas. El análisis de la cinética de quimioluminiscencia mostró que en los objetos estudiados predominan los antioxidantes de potencia media, incluidos los flavonoides, y los antioxidantes débiles (tocoferol, etc.). Una comparación de los valores de OAE calculados para los objetos estudiados y los datos de su análisis químico mostró que los productos que contienen la misma cantidad de antioxidantes con diferentes proporciones según el tipo pueden diferir en su capacidad para proteger al cuerpo de los efectos nocivos de los radicales libres. . La técnica descrita es prometedora para el estudio de objetos vegetales que contienen una mezcla de antioxidantes de varios tipos.

Palabras clave: radical libre, antioxidante, actividad antioxidante, capacidad antioxidante total, quimioluminiscencia, luminol.

Financiamiento: el trabajo fue apoyado por la Fundación Rusa para la Ciencia, subvención No. 14-15-00375.

Ej3 Para correspondencia: Georgy Konstantinovich Vladimirov

119192, Moscú, Lomonosovsky pr-t, 31, edificio 5; [correo electrónico protegido]

Artículo recibido: 10/03/2016 Artículo aceptado para publicación: 18/03/2016

Determinación quimioluminiscente de la capacidad antioxidante total en material vegetal medicinal.

1 Departamento de Biofísica Médica, Facultad de Medicina Fundamental, Universidad Estatal Lomonosov de Moscú, Moscú, Rusia

2 Departamento de Farmacognosia, Facultad de Farmacia,

La Primera Universidad Médica Estatal Sechenov de Moscú, Moscú, Rusia

Palabras clave: radical libre, antioxidante, actividad antioxidante, capacidad antioxidante total, quimioluminiscencia, luminol

Financiamiento: este trabajo fue apoyado por la Fundación Rusa para la Ciencia, subvención no. 14-15-00375.

Agradecimientos: los autores agradecen a Andrey Alekseev de la Universidad Estatal Lomonosov de Moscú por su ayuda en la realización del experimento. Se debe abordar la correspondencia: Georgiy Vladimirov

Lomonosovskiy Prospekt, d. 31, k. 5, Moscú, Rusia, 119192; [correo electrónico protegido] Recibido: 10/03/2016 Aceptado: 18/03/2016

Los radicales libres que se forman en el cuerpo alteran la estructura de las membranas celulares, lo que, a su vez, conduce al desarrollo de diversas condiciones patológicas. Los efectos oxidativos destructivos de los radicales se previenen mediante el sistema de defensa antioxidante del cuerpo, en el que los compuestos de bajo peso molecular, los interceptores de radicales (trampas), desempeñan un papel importante. Una de las fuentes de antioxidantes son las materias primas vegetales medicinales, así como los fármacos a base de ellas, cuyo estudio de su potencial antioxidante ayuda a incrementar su efecto preventivo y terapéutico.

Los principales métodos para determinar los antioxidantes se analizan en los trabajos, sin embargo, la definición de antioxidantes como compuestos químicos no da una imagen completa de las propiedades protectoras del objeto en estudio: están determinadas no solo por la cantidad de un antioxidante en particular, sino también por la actividad de cada uno de ellos. La actividad antioxidante, o actividad antioxidante, AOA, es la constante de velocidad de reacción de un antioxidante con un radical libre (kInH). El método de quimioluminiscencia (CL) permite determinar la cantidad total de radicales que se unen a los antioxidantes en una muestra (capacidad antioxidante total, TCA), y cuando se utiliza el método de modelado matemático de la cinética de CL, también la velocidad de formación y reacción de radicales con antioxidantes, es decir, AOA.

En presencia de oxígeno molecular, el radical alquilo R^ forma el radical peroxilo ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv A partir de la LH, mediante la formación de sustancias intermedias (hidroperóxido de luminol y endoperóxido de luminol), se forma una molécula del producto final de la oxidación del luminol, el ácido aminoftálico, en estado excitado electrónicamente, que emite un fotón. y como resultado se observa quimioluminiscencia. La intensidad de CL es proporcional a la tasa de producción de fotones y, a su vez, es proporcional a la concentración estacionaria de LH en el sistema. Al interactuar con los radicales, los antioxidantes interrumpen la cadena de transformaciones descrita e impiden la formación de un fotón.

Los compuestos susceptibles a la termólisis no son la única fuente posible de radicales cuando se analiza la capacidad antioxidante de una muestra mediante el método quimioluminiscente. Las alternativas son los sistemas peroxidasa de rábano picante-peróxido de hidrógeno, hemina-peróxido de hidrógeno, citocromo c-cardiolipina-peróxido de hidrógeno, etc. El esquema de reacción para la oxidación del luminol por peroxidasas se considera en el trabajo de Cormier et al. .

Las curvas cinéticas de CL para estos sistemas reflejan dos etapas de la reacción: la etapa de aumento de la intensidad de CL y la etapa de meseta o disminución gradual de la luminiscencia, cuando

La intensidad de CL es constante o disminuye lentamente. El trabajo describe dos enfoques para medir la capacidad antioxidante total que tienen en cuenta esta característica de las curvas. El método TRAP (potencial antioxidante reactivo total) se basa en la medición del período de latencia de CL t y puede utilizarse para determinar antioxidantes como el Trolox o el ácido ascórbico: se caracterizan por una alta velocidad de reacción constante con los radicales y por esta razón pueden ser llamados antioxidantes fuertes. Durante el período latente se produce su completa oxidación. El método TAR (Reactividad Antioxidante Total) mide el grado de extinción de la quimioluminiscencia q en la meseta o máximo de la curva de quimioluminiscencia:

donde I es la intensidad de quimioluminiscencia sin antioxidante y 11 es la intensidad de CL en presencia de un antioxidante. Este método se utiliza si el sistema contiene predominantemente antioxidantes débiles con constantes de velocidad de interacción con radicales bajas, mucho más bajas en comparación con la constante del luminol.

El efecto de los antioxidantes se caracteriza no solo por los indicadores t y c. Como se desprende de los trabajos, el efecto de antioxidantes como el ácido úrico en el sistema hemin-H2O2-luminol o el tocoferol, la rutina y la quercetina en el sistema citocromo c-cardiolipina-H2O2-luminol se caracteriza por un cambio en la tasa máxima. de aumento en CL (utx). Como muestran los resultados del modelado matemático de la cinética, los valores de las constantes de velocidad de interacción de estos antioxidantes con radicales están cerca del valor de la constante de luminol, por lo que dichos antioxidantes pueden denominarse antioxidantes de fuerza media.

DE = DE0 - DE,

¿Dónde DE0 y DE5 son las sumas de luz CL para un tiempo determinado? en las muestras de control y de prueba, respectivamente. El tiempo debe ser suficiente para la oxidación de todos los antioxidantes en el sistema, es decir, para que la curva CL de la muestra de prueba alcance el nivel de la curva CL de la muestra de control. Esto último supone que los investigadores no sólo deben registrar la suma luminosa del resplandor, sino también la curva cinética de CL durante un tiempo suficientemente largo, lo que no siempre se hace.

Dado que todos los parámetros medidos dependen del dispositivo y de las condiciones de medición, el efecto antioxidante de la sustancia en el sistema en estudio generalmente se compara con el efecto de un antioxidante estándar, por ejemplo Trolox.

Muchos autores han utilizado el sistema peroxidasa de rábano picante-peróxido de hidrógeno para analizar la capacidad antioxidante total de los materiales vegetales. Para estimar la cantidad de antioxidantes en las muestras se utilizó el período de latencia de CL (método TRAP) y en los trabajos se utilizó el área bajo la curva de desarrollo de CL. Sin embargo, los trabajos enumerados no proporcionan una justificación clara.

la elección de uno u otro parámetro para evaluar la OUA.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los objetos del estudio fueron muestras industriales de espino, serbal y escaramujo producidos por JSC Krasnogorskleksredstva (Rusia), así como frutos de frambuesa recolectados por los autores en la región de Moscú en condiciones naturales de crecimiento y secados a una temperatura de 60-80 °. C hasta que dejaran de soltar jugo y deformarse al presionarlos.

Los reactivos para analizar la capacidad antioxidante mediante el método quimioluminiscente fueron: KH2PO4, solución tampón 20 mM (pH 7,4); peroxidasa de raíces de rábano picante (actividad 112 unidades/mg, M = 44.173,9), solución acuosa 1 mM; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindiona, hidrazida del ácido 3-aminoftálico, M = 177,11), solución acuosa 1 mM; peróxido de hidrógeno (H2O2, M = 34,01), solución acuosa 1 mM; Soluciones de antioxidantes (ácido ascórbico, quercetina, tocoferol). Todos los reactivos son fabricados por Sigma Aldrich (EE. UU.).

La determinación de la capacidad antioxidante total se llevó a cabo registrando quimioluminiscencia en un quimioluminómetro Lum-100 (DISoft, Rusia) utilizando el software PowerGraph 3.3. Para determinar la OAE en materiales vegetales se utilizan 40 μl de luminol a una concentración de 1 mM, 40 μl de peroxidasa de rábano picante a una concentración de 0,1 μM, de 10 a 50 μl de decocción o infusión (según la concentración) y tampón fosfato en el La cantidad requerida se colocó en la cubeta del dispositivo para llevar el volumen total de la muestra a 1 ml. Se instaló la cubeta en el dispositivo y se registró CL, observando la señal de fondo. Después de 48 s de registrar la señal de fondo, se agregaron a la cubeta 100 µl de H2O2 a una concentración de 1 mM y el registro de CL se continuó durante 10 minutos. Se prepararon cuatro muestras con diferentes concentraciones de cada objeto vegetal. También se registró CL para soluciones de ácido ascórbico, quercetina y tocoferol en cinco concentraciones diferentes para cada uno de los antioxidantes. Posteriormente, la OAU de las muestras de decocciones e infusiones se recalculó a quercetina.

alcanzó una meseta, lo que indica la destrucción completa de los antioxidantes en el sistema. Las diluciones de las muestras estudiadas y las concentraciones de soluciones de antioxidantes estándar (indicadas en los títulos de las figuras) se seleccionaron de tal manera que todas las curvas cinéticas de CL se midieron con la misma sensibilidad del dispositivo.

La capacidad antioxidante se calculó a partir del cambio en el área (AS) bajo la curva cinética de quimioluminiscencia (suma de luz) tras la adición de una sustancia que contiene un antioxidante. Para ello, calculamos S0 para un sistema sin antioxidante y le restamos el área SS, que caracteriza el sistema al que se le añadió el antioxidante. El valor de AS depende de la sensibilidad del quimioluminómetro y de las condiciones de medición. La relación AS/C ■ V (donde C es la concentración del material biológico en estudio en la cubeta, g/l, y V es el volumen de la cubeta, l) expresa la capacidad antioxidante de 1 g del material estudiado, es decir, materias primas vegetales.

De manera similar, calculamos la capacidad antioxidante ASa de una solución de un antioxidante estándar, por ejemplo, quercetina, colocada en el mismo volumen de la mezcla de reacción. La relación AS/CÄ ■ V (donde CA es la concentración en peso del antioxidante en la cubeta, g/l) expresa la capacidad antioxidante de 1 g de antioxidante.

Para cada uno de los antioxidantes estándar, se registró la señal de soluciones de varias concentraciones para garantizar que los cálculos estuvieran dentro de una relación lineal y que los resultados obtenidos fueran reproducibles. De hecho, se obtuvo una dependencia lineal (ASa = kA ■ CA) de la señal con la concentración, a partir de la cual se calculó el coeficiente estequiométrico kA. Según el criterio de Fisher, los valores de kA obtenidos para los antioxidantes estándar son estadísticamente significativos con una probabilidad de 0,975. A continuación, se registró la señal de cuatro concentraciones para cada una de las cuatro muestras de plantas, y para todas las muestras se obtuvo una dependencia lineal de la señal con la concentración (AS = k ■ C), a partir de la cual se calculó el coeficiente estequiométrico k. Con una probabilidad de 0,975 (prueba de Fisher), los valores de k obtenidos para las muestras de plantas son estadísticamente significativos. La capacidad antioxidante total del material vegetal en términos de masa del antioxidante estándar (mg%) se encontró usando la fórmula

OAE = k ■ 105. k

Los valores se presentaron como media aritmética ± desviación estándar (M ± 5) en p<0,05.

RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN

Un estudio de la cinética de la quimioluminiscencia en presencia de ascorbato de sodio (Fig. 1) mostró que este antioxidante se caracteriza por un período latente en el que la CL se suprime casi por completo. Su duración es proporcional a la cantidad de antioxidante en el sistema. En este caso, no cambia ni la pendiente de las curvas CL ni la intensidad de CL en la meseta. Esto se explica por el hecho de que el ácido ascórbico es un fuerte antioxidante que intercepta todos los radicales formados en el sistema, incluidos los radicales luminol, y el CL no se desarrolla hasta que se oxida todo el ascorbato.

El efecto del tocoferol (Fig. 2) se manifestó por una disminución en la intensidad de CL en la meseta, que es típica de los antioxidantes débiles, aunque el tocoferol se considera uno de los más

poderosos antioxidantes. Quizás esta discrepancia se deba al hecho de que en nuestro experimento los radicales libres estaban en una solución acuosa, mientras que el efecto del tocoferol generalmente se estudia en medios no polares. En un estudio en el que la fuente de radicales era un complejo de citocromo c con cardiolipina y la reacción con luminol se producía dentro de este complejo, el tocoferol tenía propiedades de antioxidante de potencia media.

Habiendo estudiado el efecto de varias concentraciones de quercetina en nuestro sistema (Fig. 3) y comparando sus curvas cinéticas con las del ascorbato de sodio y el tocoferol, se puede observar que el efecto principal de la quercetina se manifiesta en un cambio en la pendiente de la curvas, es decir, la tasa de desarrollo de CL, que es típica de los antioxidantes de potencia media.

Las curvas de CL para todas las decocciones estudiadas (Fig. 4) se asemejan a las curvas de quercetina con una ligera disminución en la intensidad de CL al final, es decir, al alcanzar

Tiempo, minutos

Arroz. 1. Efecto del ascorbato de sodio sobre la cinética de quimioluminiscencia.

Concentraciones de los componentes del sistema: luminol - 40 µM, peroxidasa de rábano picante - 4 nM, peróxido de hidrógeno - 100 µM. Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - ascorbato de sodio 0,25 µM.

meseta. Como se muestra en el trabajo, este comportamiento es típico de los antioxidantes de potencia media, que en nuestro caso incluyen polifenoles: flavonoides y taninos. Para la infusión de frutos de frambuesa (Fig. 4, D), hay una disminución notable de la quimioluminiscencia a nivel de meseta, que es típica de los antioxidantes débiles, que en este caso es el tocoferol. En cuanto a quercetina y tocoferol, la infusión de frambuesa contiene 4,7 ± 0,9 µmol/g de quercetina y 11,9 ± 0,8 µmol/g de tocoferol.

Al comparar las curvas de quimioluminiscencia obtenidas para diferentes concentraciones de los cuatro extractos acuosos de materiales vegetales estudiados, se demostró que la contribución de los antioxidantes medios y débiles a la capacidad antioxidante total de las muestras disminuyó en la siguiente serie: infusión de fruta de frambuesa (Fig. 4). , D), decocción de escaramujo (Fig.4, B), decocción de frutos de serbal (Fig.4, A), decocción de frutos de espino (Fig.4, B). En la tabla se dan los valores de AS en función de la concentración C de la sustancia estudiada en la cubeta y los valores de la capacidad antioxidante total en términos de quercetina.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los datos obtenidos durante los experimentos y los valores de OAE de los objetos estudiados calculados en base a ellos se compararon con el contenido de los principales antioxidantes en ellos, determinado mediante métodos de análisis químicos. A pesar de que la correlación positiva entre la cantidad total de antioxidantes y TAU en diferentes objetos es innegable, todavía existen diferencias notables entre estos indicadores. Por ejemplo, si tomamos la suma del contenido de flavonoides, taninos y ácido ascórbico, resulta ser mayor que el TAU calculado para todos los objetos estudiados, excepto la decocción de frutos de espino (tabla).

46 Tiempo, minutos

Yo" "h chi----.

Arroz. 2. Efecto del tocoferol sobre la cinética de quimioluminiscencia.

Concentraciones de los componentes del sistema: luminol - 40 µM, peroxidasa de rábano picante - 4 nM, peróxido de hidrógeno - 100 µM. Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,01 µM; 3 - 0,025 µM; 4 - 0,06 µM; 5 - 0,1 µM; 6 - tocoferol 0,2 µM.

46 Tiempo, minutos

Arroz. 3. Efecto de la quercetina sobre la cinética de la quimioluminiscencia. Concentraciones de los componentes del sistema: luminol - 40 µM, peroxidasa de rábano picante - 4 nM, peróxido de hidrógeno - 100 µM. Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,02 µM; 3 - 0,03 µM; 4 - 0,04 µM; 5 - 0,05 µM; 6 - quercetina 0,06 µM.

Tiempo, minutos

46 Tiempo, minutos

120 yo 100 80\60 40 20

46 Tiempo, minutos

Arroz. 4. Efecto de decocciones de frutos de serbal (A), espino (B), escaramujo (C) e infusión de frutos de frambuesa (D) sobre la cinética de quimioluminiscencia. Concentraciones de los componentes del sistema: luminol - 40 µM, peroxidasa de rábano picante - 4. nM, peróxido de hidrógeno - 100 µM. (A) Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l decocción de frutos de serbal. (B) Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l decocción de frutos de espino. (B) Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l decocción de rosa mosqueta. (D) Curvas: 1 - muestra de control; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l infusión de frambuesa.

en el sistema peroxidasa-luminol-peróxido de hidrógeno se correlaciona con el contenido de compuestos triterpénicos. Sin embargo, en el trabajo de los mismos autores, cuyo objeto de estudio fue otra planta, no observaron correlación de la OAE con el contenido de ningún grupo de sustancias, incluidos los flavonoides.

Estas discrepancias están asociadas con al menos tres factores. En primer lugar, es importante la actividad de los antioxidantes, es decir, la velocidad de su interacción con los radicales, que es diferente para los distintos antioxidantes incluidos en la muestra de la planta. Según Izmailov, las constantes de velocidad de las reacciones correspondientes para mexidol, tocoferol y quercetina se correlacionan en 0,04: 2: 60. En segundo lugar, cada molécula de antioxidante, al entrar en una reacción química, puede interceptar un número diferente de radicales. Según el trabajo, la quercetina, los ácidos úrico y ascórbico interceptaron 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 y 0,5 ± 0,2 radicales por molécula de antioxidante reaccionada, respectivamente (se utilizó el sistema hemin-H2O2-luminol). En tercer lugar, los resultados del estudio podrían verse influidos por la presencia de actividad peroxidasa en las propias muestras de plantas, como en el trabajo, así como por la presencia de calcio en las muestras, que, como se muestra en el trabajo, es capaz de aumentar. la actividad de la peroxidasa de rábano picante en determinadas condiciones. Esto generalmente conduce a más

mayor intensidad de CL en la meseta que en las curvas de control, lo que, sin embargo, no observamos.

El primer factor limita drásticamente el uso de un parámetro como el cambio en la suma de luz, ya que el tiempo para medir la quimioluminiscencia debe ser mayor que el tiempo para el consumo de todos los antioxidantes en la muestra de prueba. La aparición de este momento sólo puede juzgarse midiendo la cinética de la quimioluminiscencia. Además, la contribución de los antioxidantes débiles a la OAU se subestima considerablemente, ya que el tiempo para su oxidación completa es muchas veces mayor que la duración aceptable de la medición (10-20 min).

El coeficiente estequiométrico del antioxidante es aún más importante. El número de radicales n interceptados por él es igual a

donde p es el coeficiente estequiométrico y Am es el cambio en la concentración del antioxidante durante el tiempo de medición, en nuestro caso, la concentración inicial de la sustancia de prueba en la muestra de prueba.

La diferencia en la suma luminosa de la luminiscencia en ausencia del antioxidante y en su presencia es proporcional a n. El número total de radicales interceptados es igual a n = Y.p. metro,

donde es el coeficiente estequiométrico de un antioxidante particular y m es su concentración durante la medición

Objeto de estudio Flavonoides, mg%* Taninos, mg%* Ácido ascórbico, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. unidades TAU, mg% quercetina

Decocción del fruto de serbal 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Decocción de rosa mosqueta 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Decocción del fruto del espino 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infusión de frutos secos de frambuesa 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Nota: * - datos de la literatura, . AS: cambio en la suma de luz de la muestra, rel. unidades, C - concentración de la muestra en la cubeta, g/l. Los valores calculados son confiables en p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

renia. El número total de radicales interceptados ciertamente no es igual a la cantidad total de antioxidantes, ya que los coeficientes pt no sólo no son iguales a la unidad, sino que también difieren significativamente para los diferentes antioxidantes.

El valor de n es proporcional a la diferencia en sumas de luz medidas durante un tiempo determinado entre una muestra que contiene un antioxidante y una muestra de control que no contiene antioxidantes:

donde k es un coeficiente que es constante en las mismas condiciones de medición.

Seleccionamos las condiciones para evaluar la capacidad antioxidante total de las materias primas vegetales registrando la cinética de quimioluminiscencia en un sistema que consta de peroxidasa de rábano picante, peróxido de hidrógeno y luminol (concentraciones de componentes: 4 nM, 100 µM y 40 µM, respectivamente; fosfato 20 mM). tampón, pH 7,4),

aseguró la oxidación de antioxidantes fuertes (ácido ascórbico) y antioxidantes de potencia media (quercetina) en 10 minutos. Esta duración de la medición es cómoda y garantiza la calidad de medición requerida.

El análisis de la cinética de la quimioluminiscencia mostró que en los objetos estudiados (decocciones de frutos de serbal, escaramujo, espino e infusión de frutos de frambuesa) los principales antioxidantes son antioxidantes de potencia media, incluidos flavonoides, y de potencia débil (tocoferol, etc.). A partir de la disminución de la suma de luz de quimioluminiscencia, se calculó la capacidad antioxidante total de los objetos estudiados. Una comparación de los valores de TAU obtenidos con los resultados del análisis químico mostró que los productos que contienen la misma cantidad de antioxidantes en diferentes proporciones pueden diferir en su capacidad para proteger eficazmente al cuerpo de los efectos nocivos de los radicales libres. La técnica descrita es prometedora para el estudio de objetos vegetales que contienen una mezcla de varios antioxidantes. Al mismo tiempo, se caracteriza por la sencillez y el bajo coste de la investigación. La combinación de la medición de la cinética de quimioluminiscencia con el modelado matemático de reacciones permitirá no solo automatizar el proceso de determinación de TAU, sino también determinar la contribución de grupos individuales de antioxidantes al indicador.

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