Détermination de l'activité antioxydante totale. Thèse : propriétés antioxydantes de la dihydroquercétine. Le texte de l'ouvrage scientifique sur le thème "Méthode chimiluminescente pour déterminer la capacité antioxydante totale des matières végétales médicinales"

19.09.2023

L'invention concerne l'industrie alimentaire et peut être utilisée pour déterminer l'activité antioxydante totale. La méthode est réalisée comme suit : l'analyte interagit avec le réactif 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-phénanthroline. L'acide ascorbique (AA) réagit avec le même réactif, qui est ajouté dans un rapport de 1:100. Ensuite, incuber pendant au moins 90 minutes et photomètre à 510 ± 20 nm. Après cela, la dépendance de l'ampleur du signal analytique sur la quantité de substance est établie et la valeur de l'AOA totale est calculée. La méthode présentée permet de déterminer de manière moins laborieuse et plus fiable l'activité antioxydante totale des matières végétales et des produits alimentaires à base de celles-ci. 2 salaire f-ly, 1 ill., 5 tableaux.

L'invention concerne la chimie analytique et peut être utilisée pour déterminer l'activité antioxydante totale (AOA) de matières végétales et de produits alimentaires basés sur celle-ci.

Il existe une méthode coulométrique connue pour déterminer l'AOA total du thé, basée sur l'interaction d'extraits aqueux du produit avec des composés bromés générés électriquement (I.F.Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov. Évaluation coulométrique de la capacité antioxydante des extraits de thé avec électriquement brome généré // Journal of Analyst Chemistry 2001. T.56. P.627-629). Le choix des composés bromés électrogénérés comme titrant est dû à leur capacité à entrer dans diverses réactions : radicalaire, redox, substitution électrophile et addition au niveau de liaisons multiples. Cela nous permet de couvrir une large gamme de composés de thé biologiquement actifs qui possèdent des propriétés antioxydantes. Les inconvénients de cette méthode sont la possibilité d'une réaction de bromation avec des substances qui ne sont pas des antioxydants et l'expression de la valeur résultante de l'AOA totale en unités d'électricité (kC/100 g), ce qui rend difficile l'évaluation des résultats obtenus.

Il existe une méthode voltammétrique connue pour déterminer l'activité antioxydante totale par la variation relative du courant d'électroréduction de l'oxygène dans la plage de potentiel de 0,0 à -0,6 V (rel. sat. h.s.e.) sur une électrode à film de mercure (Pat. 2224997, Russie, MPC 7 G 01 N 33/01 Méthode voltamétrique pour déterminer l'activité totale des antioxydants / Korotkova E.I., Karbainov Yu.A - demande 06.06.2004 ; L'inconvénient de cette méthode est que des réactions électrochimiques secondaires se produisent, ce qui entraîne une diminution de l'efficacité de la détermination des antioxydants, ce qui entraîne une diminution de la fiabilité des résultats.

Il existe une méthode connue pour surveiller l'AOA totale d'agents antioxydants préventifs et thérapeutiques par peroxydation lipidique en malonaldéhyde avec détection spectrophotométrique ou chimiluminescente (Pat. 2182706, Russie, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. activité antioxydante des fonds antioxydants préventifs et thérapeutiques / Pavlyuchenko I.A., Fedosov S.R. - n° 2001101389/14 ; De plus, l’activité antioxydante est inversement proportionnelle au niveau de produits de peroxydation lipidique. L'inconvénient de cette méthode peut être considéré comme une gamme limitée d'objets analysés, car dans ces conditions, un seul groupe d'antioxydants est déterminé - les lipides.

Il existe une méthode connue pour déterminer l'AOA totale d'un extrait végétal, qui consiste à incuber l'extrait avec du linétol et du sulfate de fer (II), à initier une réaction d'oxydation par irradiation UV et à interagir ultérieurement avec l'acide thiobarbiturique en présence de Triton X- 100 (Demande 97111917/13, Russie, IPC 6 G 01 N 33/00. Méthode de détermination de l'activité antioxydante générale / Rogozhin V.V. - Appl. 07/08/1997 ; Lors de la spectrophotométrie, un mélange d'éthanol et de chloroforme dans un rapport de 7:3 est utilisé. La valeur AOA d'un matériel biologique est déterminée par le rapport de l'accumulation du produit de réaction - le malondialdéhyde dans un échantillon contenant un extrait à un échantillon contenant un pro-oxydant. L'inconvénient de cette méthode est la possibilité de réactions secondaires lors de l'irradiation UV, ce qui réduit la fiabilité des résultats d'analyse obtenus.

Les méthodes énumérées pour déterminer l'AOA total présentent un certain nombre d'inconvénients : intensité de travail élevée, faible fiabilité, la valeur mesurée de l'AOA total n'est liée et n'est comparable à aucune substance généralement acceptée.

L'analogue le plus proche de l'invention revendiquée est une méthode de détermination de l'AOA totale des plantes médicinales en mesurant la chimiluminescence qui se produit lors de la réaction avec le luminol en présence de l'agent oxydant peroxyde d'hydrogène (M.Kh.Navas, A.M.Khiminets, A.G.Azuero Détermination du pouvoir réducteur des teintures de graines des Canaries par chimiluminescence // Journal of analytique chemistry 2004. T.59. Pour quantifier l'AOA total, la capacité réductrice de l'extrait de matières premières médicinales et l'activité d'un puissant antioxydant - l'acide ascorbique en une quantité de 25 à 110 μg ont été comparées. En comparaison avec les méthodes répertoriées, le prototype utilise le peroxyde d'hydrogène comme agent oxydant, qui interagit avec une large gamme d'antioxydants, et la valeur mesurée de l'AOA total de l'objet est déterminée et exprimée par rapport à l'acide ascorbique, qui est généralement un antioxydant reconnu, qui permet d'obtenir des résultats fiables tout en conservant d'autres inconvénients. Les inconvénients incluent également la complexité de l'équipement utilisé dans la méthode.

L'objectif technique de l'invention revendiquée est de développer un procédé fiable et moins exigeant en main-d'œuvre pour déterminer l'activité antioxydante totale de matières végétales et de produits alimentaires basés sur celle-ci.

Pour résoudre le problème technique, il est proposé d'interagir l'analyte avec le réactif 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-phénanthroline et l'acide ascorbique (AA) avec le même réactif, qui est ajouté dans un rapport de 1:100. , incubé pendant au moins 90 minutes, photométrique à 510 ± 20 nm, suivi de l'établissement de la dépendance de la valeur du signal analytique sur la quantité de substance et du calcul de la valeur de l'AOA totale. En particulier, le calcul peut être effectué à l'aide de la formule (I), dérivée de l'équation de correspondance quantitative entre l'objet étudié et l'acide ascorbique :

où a, b sont les coefficients de l'équation de régression pour la dépendance du signal analytique sur la quantité de AC ;

a", b" - coefficients de l'équation de régression pour la dépendance du signal analytique sur la quantité de l'objet étudié ;

x soleil - masse de l'agent réducteur (échantillon) étudié, mg.

L'utilisation du réactif proposé dans les conditions spécifiées a permis d'élargir la plage linéaire et de réduire la limite inférieure des quantités déterminées d'acide ascorbique. L'ensemble proposé de caractéristiques essentielles permet de déterminer l'AOA total d'une large gamme de matières végétales et de produits alimentaires à base de celles-ci.

Les équations de correspondance quantitative relient la dépendance du signal analytique à la quantité d'acide ascorbique et la dépendance du signal analytique à la quantité de l'objet à tester dans des conditions d'activité antioxydante égale.

Après avoir traité les résultats des mesures photométriques de l'amplitude du signal analytique à l'aide de la méthode des moindres carrés (K. Derffel Statistics in analytique chemistry. - M. : "Mir", 1994. P.164-169 ; A.K. Charykov Traitement mathématique du résultats d'analyse chimique - L. : Chemistry, 1984. pp. 137-144) ces dépendances ont été décrites par une fonction de régression linéaire : y=ax+b, où a est le coefficient de régression, b est le terme libre. Le coefficient a dans l'équation de régression est égal à la tangente de l'angle d'inclinaison de la droite par rapport à l'axe des x ; coefficient b - la distance le long de l'axe y depuis l'origine (0,0) jusqu'au premier point (x 1, y 1).

Les coefficients a et b sont calculés à l'aide des formules :

L'équation de régression pour la dépendance de l'AC à la quantité d'acide ascorbique à un moment donné a la forme :

y AK = a x AK (mg) + b,

équation de régression pour la dépendance de AC à la quantité de l'objet étudié (agent réducteur) :

y VOST =a" x VOST (mg)+b",

où en AK, en VOST est la densité optique de la solution photométrique ;

x AA (mg), x VOST (mg) - concentration d'acide ascorbique (agent réducteur) dans la solution ;

puis, en égalisant les valeurs des fonctions, on obtient la formule (I) pour calculer l'activité antioxydante de l'objet étudié en unités de quantité (mg) d'acide ascorbique.

Le dessin montre la dépendance du signal analytique sur la quantité d'agent réducteur.

La densité optique des solutions analysées a été mesurée à l'aide d'un photoélectrocolorimètre KFK-2MP.

Il est connu (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Wünsch Composés complexes en chimie analytique - M. : Mir, 1975. - 531 p.) que l'o-phénanthroline forme un chélate hydrosoluble avec le fer( II) couleur rouge-orange, caractérisée par un maximum d'absorption à λ = 512 nm. Par conséquent, dans la méthode proposée, la photométrie est réalisée à λ = 510 ± 20 nm.

L'optimisation de la composition du réactif et de sa quantité introduite dans la réaction a été réalisée sur la base des résultats d'un plan expérimental multifactoriel utilisant la méthode du « carré latin », qui consistait à changer tous les facteurs étudiés dans chaque expérience, et à chaque niveau. de chaque facteur ne se produit qu'une seule fois avec différents niveaux d'autres facteurs. Cela vous permet d'isoler et d'évaluer séparément l'effet provoqué par chaque facteur étudié.

Les facteurs étaient : la quantité de Fe(III), d’o-phénanthroline et le volume du réactif introduit dans la réaction. La combinaison de facteurs doit fournir une large gamme de linéarité du signal analytique (AS) avec une sensibilité suffisante, d'une part, et une stabilité du réactif dans le temps, d'autre part. Cela a permis d'identifier les niveaux suivants pour chaque facteur :

quantité de Fe(III) : 0,003 M (A 1) ; 0,006 M (A2) ; 0,009 M (A3) ;

quantité d'o-phénanthroline : 0,01 M (B 1) ; 0,02 M (B2) ; 0,03 M (B3) ;

volume de réactif : 0,5 ml (C 1) ; 1,0 ml (C2); 2,0 ml (C3) (Tableau 1).

Pour sélectionner la combinaison optimale de niveaux de facteurs, nous avons obtenu les dépendances d'étalonnage de l'AC sur la quantité d'acide ascorbique dans la plage de 10 à 150 µg (ce qui est nécessaire pour confirmer la linéarité de la fonction), calculé l'équation de régression de la dépendance obtenue , puis calculé la valeur de AC pour une quantité donnée (120 μg) d'acide ascorbique. Ainsi, pour chaque composition de réactifs (facteurs A, B), le volume (facteur C) pour lequel la valeur AC est maximale a été sélectionné. Cela nous a permis de réduire à neuf le nombre de combinaisons considérées (tableau 2).

En comparant les AC totales pour chaque niveau, nous avons identifié les montants avec la valeur maximale : ΣA 2 (0,991) ; ΣB 1 (1,066); ΣC2 (1,361). Cela nous a permis de conclure que la composition optimale des réactifs est : 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-phénanthroline avec un volume introduit dans la réaction de 1,0 ml pour 100 ml de solution.

A la concentration optimale du réactif, nous avons étudié l'évolution de la dépendance de l'AS à la concentration d'acide ascorbique et de certains agents réducteurs courants dans les objets naturels (tanin, rutine, quercétine) à différents temps d'incubation du mélange réactionnel (30, 60 , 90, 120 minutes). Il a été constaté que pour tous les agents réducteurs étudiés, la dépendance de l'AC à leur teneur est linéaire dans la plage de 10 à 150 µg (voir dessin) et la valeur de l'AC dépend du temps d'incubation (tableau 3).

Le dessin montre que la modification de l'AC sous l'influence de la rutine est insignifiante, que les tanins se rapprochent et que la quercétine dépasse la dépendance similaire à l'acide ascorbique. En considérant l'évolution de l'AS en fonction du temps d'incubation pour tous les agents réducteurs étudiés (tableau 3), il a été constaté qu'une stabilisation du signal analytique dans le temps est observée à partir de 90 minutes.

Tableau 3 Evolution de la CA des agents réducteurs au fil du temps
Substance d'essai	m substance, mg/cm 3	Signal analytique
Substance d'essai	m substance, mg/cm 3	Temps d'incubation du mélange réactionnel, min
30	60	90	120
Acide ascorbique	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tanin	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutine	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Quercétine	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Pour prouver le caractère sommatif de la valeur AOA déterminée, l'effet du réactif Fe (III) - o-phénanthroline sur des solutions modèles, qui comprenaient des agents réducteurs : tanin, rutine, quercétine et acide ascorbique dans diverses proportions, a été étudié. Le tableau 4 présente les résultats de l'analyse des mélanges modèles.

Tableau 4 Résultats de l'analyse des mélanges modèles (P = 0,95 ; n = 3)
Nombre de composants dans le mélange	AOA total, calculé, µgAC	AOA total, trouvé, µgAC
introduit	AOA total, calculé, µgAC	AOA total, trouvé, µgAC	en termes d'AK
AK	Tanin	Rutine	Quercétine	AK	Tanin	Rutine	Quercétine
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Le calcul de la valeur théorique de l'AOA totale a été réalisé à l'aide d'équations de correspondance quantitatives caractérisant la capacité antioxydante de l'agent réducteur étudié par rapport à l'acide ascorbique, dans des conditions d'activité antioxydante égale : .

La valeur de l'AOA expérimentale (trouvée) a été calculée à l'aide de l'équation de régression moyenne pour la dépendance de l'AC à la quantité d'acide ascorbique. D'après les résultats présentés dans le tableau 4, il est clair que les valeurs AOA obtenues expérimentalement sont en accord satisfaisant avec celles calculées théoriquement.

Ainsi, la valeur AOA déterminée est un indicateur récapitulatif et la détermination de sa valeur à l'aide d'équations de correspondance quantitatives est correcte.

La méthode proposée a été testée sur des échantillons réels. Pour déterminer l'AOA totale d'un échantillon réel ou de son extrait, les dépendances d'étalonnage de l'AC sur la quantité d'analyte et d'acide ascorbique ont été obtenues avec un temps d'incubation du mélange réactionnel d'au moins 90 minutes. Le calcul de l'AOA total a été effectué selon la formule (I) et exprimé en mg d'acide ascorbique par gramme d'objet à tester (mgAA/g).

Pour confirmer l'exactitude de la méthode proposée, ces échantillons ont été testés à l'aide de méthodes connues, évaluant la teneur en acide ascorbique (GOST 24556-89 Produits transformés de fruits et légumes. Méthodes de détermination de la vitamine C) et des agents réducteurs prédominants : tanin dans le thé (GOST 19885-74 Thé. Méthodes de détermination du contenu tanin et caféine), dans les cynorrhodons - la quantité d'acides organiques (GOST 1994-93 Cynorhodons. Conditions techniques) (Tableau 5).

travail d'études supérieures

1.4 Méthodes de recherche sur les antioxydants

les activités antioxydantes sont classées : selon les méthodes d'enregistrement de l'AOA manifestée (volumétrique, photométrique, chimiluminescente, fluorescente, électrochimique) ; par type de source d'oxydation ; par type de composé oxydé ; par la méthode de mesure du composé oxydé.

Cependant, les méthodes les plus connues pour déterminer l’activité antioxydante sont :

1 TEAC (capacité antioxydante équivalente trolox) : la méthode est basée sur la réaction suivante :

Metmyoglobine + H 2 O 2 > Ferrylglobine + ABTS > ABTS * + AO.

La méthode des équivalents Trolox (TEAC) est basée sur la capacité des antioxydants à réduire les cations radicaux 2,2-azinobis (ABTS) et ainsi à inhiber l'absorption dans la région des grandes longueurs d'onde du spectre (600 nm). Un inconvénient majeur de la méthode est la réaction en deux étapes pour produire le radical. Cela allonge la durée de l'analyse et peut augmenter la dispersion des résultats, malgré le fait qu'un ensemble standardisé de réactifs soit utilisé pour l'analyse.

2 FRAP (pouvoir antioxydant réducteur ferrique) : la méthode est basée sur la réaction suivante :

Fe(III)-Tripyriditriazine+AO>Fe(II)-Tripyridyltriazine.

Capacité réductrice/antioxydante du fer (FRAP). La réaction utilisée ici est la réduction de Fe(III)-tripyridyltriazine en Fe(II)-tripyridyltriazine. Cependant, cette méthode ne permet pas de déterminer le dosage de certains antioxydants, comme le glutathion. Cette méthode permet la détermination directe des antioxydants de faible poids moléculaire. A faible pH, la réduction du complexe Fe(III)-tripyridyltriazine en complexe Fe(II) s'accompagne de l'apparition d'une couleur bleue intense. Les mesures sont basées sur la capacité des antioxydants à supprimer l'effet oxydant des espèces réactionnelles générées dans le mélange réactionnel. Cette méthode est simple, rapide et peu coûteuse à mettre en œuvre.

3 ORAC (capacité d'absorption des radicaux oxygène) : la méthode est basée sur la réaction suivante :

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Détermination de la capacité d'absorption des radicaux oxygénés (ORAC). Dans cette méthode, la fluorescence d'un substrat (phycoérythrine ou fluorescéine), résultant de son interaction avec les ROS, est enregistrée. Si l'échantillon testé contient des antioxydants, alors une diminution de la fluorescence est observée par rapport à l'échantillon témoin. Cette méthode a été initialement développée par le Dr Guohua Kao au National Institute on Aging en 1992. En 1996, le Dr Kao a fait équipe avec le Dr Ronald Pryer dans un groupe conjoint au USDA Aging Research Center, où la méthode semi-automatique a été développée. créé.

4 TRAP (paramètre antioxydant total radical trapping) : la méthode est basée sur la réaction suivante :

AAPH+AO>AAPH* + PL (FE).

Cette méthode utilise la capacité des antioxydants à interagir avec le dichlorhydrate du radical peroxyle 2,2-azobis(2-amidinopropane) (AAPH). Les modifications TRAP consistent en des méthodes d'enregistrement du signal analytique. Le plus souvent, au stade final de l'analyse, le radical peroxy AAPH interagit avec un substrat luminescent (luminol), fluorescent (diacétate de dichlorofluorescéine, DCFH-DA) ou autre substrat optiquement actif.

Le dérivé hydrosoluble de la vitamine E Trolox (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxy) est utilisé comme étalon pour les méthodes TEAC, ORAC et TRAP.

Récemment, l’intérêt pour l’utilisation de méthodes électrochimiques pour évaluer l’activité antioxydante s’est accru. Ces méthodes ont une sensibilité élevée et une analyse rapide.

L'évaluation de l'activité antioxydante de certains produits alimentaires est réalisée par la méthode de potentiométrie, basée sur l'utilisation de la propriété des substances antioxydantes de participer aux réactions redox dues aux groupes énol (-OH) et sulfhydryle (-SH).

La détermination des propriétés antioxydantes des solutions repose sur l'interaction chimique des antioxydants avec le système médiateur, ce qui entraîne une modification de son potentiel rédox. Une cellule électrochimique est un récipient contenant une solution tampon K-Na-phosphate, un système médiateur Fe(III)/Fe(II) et une électrode complexe avant de mesurer le potentiel redox. L'activité antioxydante est évaluée en g-eq/l.

La méthode ampérométrique pour déterminer l'activité antioxydante est basée sur la mesure du courant électrique qui se produit lors de l'oxydation de la substance à tester à la surface de l'électrode de travail, qui est sous un certain potentiel. La sensibilité de la méthode ampérométrique est déterminée à la fois par la nature de l'électrode de travail et par le potentiel qui lui est appliqué. La limite de détection du détecteur ampérométrique de polyphénols et de flavonoïdes se situe au niveau du nano-picogramme ; à des concentrations aussi faibles, la probabilité d'une influence mutuelle des différents antioxydants lorsqu'ils sont présents ensemble, en particulier la manifestation du phénomène de synergie, est moindre ; . Les inconvénients de la méthode incluent sa spécificité : dans ces conditions, les antioxydants eux-mêmes oxydés ou réduits dans la région des potentiels d'électroréduction de l'oxygène ne peuvent pas être analysés. Les avantages de la méthode incluent sa rapidité, sa prostate et sa sensibilité.

Méthode de coulométrie galvanostatique utilisant des oxydants générés électriquement - la méthode est applicable à l'analyse des antioxydants liposolubles.

Différentes méthodes ont été développées pour le dosage de l'acide ascorbique :

méthode ampérométrique utilisant une électrode d'aluminium modifiée par un film d'hexacyanoferrate de nickel (II) par simple immersion dans une solution ;

un procédé de détermination spectrophotométrique et visuelle en phase solide de l'acide ascorbique utilisant un xérogel d'acide silicique modifié avec un réactif de Wawele et du cuivre (II) comme poudre indicatrice ;

La détermination chimioluminescente de l'acide ascorbique peut être effectuée par la méthode d'injection en flux utilisant la réaction chimioluminescente de la rhodamine B avec le cérium (IV) dans un milieu acide sulfurique.

détermination de l'acide ascorbique dans la plage de 10 -8 -10 -3 g/cm 3 par voltammétrie anodique en milieu aqueux et aqueux-organique.

La méthode la plus courante est la méthode FRAP, car elle est rapide et très sensible. Au cours des dernières décennies, un grand nombre de méthodes variées ont été développées pour déterminer l'activité antioxydante à l'aide de la méthode FRAP (tableau 1).

Tableau 1 Développement de la méthode FRAP et son application pour déterminer l'activité antioxydante de divers objets

	Objets d'analyse	Remarques
	Plasma sanguin	t=4min. La stœchiométrie et l'additivité de la réaction ont été étudiées.
	Thé, vin	Détermination de l'AOA due aux polyphénols
		Les valeurs AOA de différentes variétés de thé ont été comparées
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Solutions modèles	t=30min. L'influence d'un solvant non aqueux a été révélée
	Plantes
	Sang, tissus	Méthode PIA. L'influence des substances étrangères a été testée.
Firuzi, Lacanna, Petrucci, etc.	Solutions modèles	La sensibilité de détermination des différents AO a été étudiée en fonction de leur structure et de leur potentiel rédox.
Katalinic, Milos,	Vins divers
Temerdashev, Tsyupko et autres.	Mélanges de modèles
Loginova, Konovalova	Médicaments Médicaments	Méthode d'essai
Temerdashev, Tsyupko et autres.	Vins rouges secs	Corrélation de l'AOA avec d'autres indicateurs de la qualité du vin
Suite du tableau 1
	Mélanges de modèles	La sensibilité de la détermination de différents AO a été étudiée
Verchinine, Vlasova, Tsyupko	Mélanges de modèles	Le signal s'est révélé non additif en cas de manque d'agent oxydant.
Anisimovich, Deineka et autres.	Solutions modèles	Des paramètres cinétiques pour évaluer l'AOA ont été proposés.

Remarques : Conventionnellement désigné : analyse par injection FIA-flow, TPTZ-tripyridyltriazine, DIP-2,2,-dipyridyl, PHEN-o-phénanthroline, acide DPA-pyridinedicarboxylique, FZ-ferrozine, acide AA-ascorbique, CT-catéchol, t - temps d'exposition, min.

Interaction entre protéines et polyélectrolytes dans des solutions aqueuses

Diverses méthodes analytiques sont utilisées pour caractériser les complexes protéine-polyélectrolyte. Les méthodes instrumentales fournissent des informations sur les propriétés structurelles et optiques, et déterminent également la dynamique et la nature de la liaison des PEC...

Effet des composés d-métal sur la vitesse de dissociation d'une molécule d'eau dans une membrane bipolaire

Dans le processus de synthèse de nouveaux BPM, une grande attention doit être accordée à l'étude des propriétés des échantillons obtenus pour la sélection ultérieure des conditions de synthèse garantissant l'amélioration des caractéristiques électrochimiques des membranes synthétisées...

Drogues de synthèse et cannabinoïdes synthétiques

La détection des cannabinoïdes synthétiques dans les mélanges de plantes peut être réalisée par diverses méthodes physico-chimiques, telles que la chromatographie-spectrométrie de masse, la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie sur couche mince et la chromatographie liquide haute performance...

Développement d'une méthode de détermination des flavonoïdes dans les matières végétales médicinales

Synthèse et propriétés pharmacologiques des quinolinones-2

Objet d'étude : Quinolinone-2. Méthode de recherche : À l'aide du programme informatique « Marvin JS », la structure de la substance a été créée. Elle a ensuite été envoyée sur le site « http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php » pour des recherches plus approfondies...

Méthode spectrale thermique pour étudier les produits d'évaporation des polymères époxy

Technologie de production de chitosane hautement purifié à partir de coquilles de crustacés

Détermination du poids moléculaire du chitosane Le poids moléculaire du chitosane a été déterminé par viscosimétrie selon une méthode standard. Des solutions de concentration 0,05 et 0,5 g/dL ont été préparées en dissolvant un échantillon de poudre de polymère dans un tampon acétate (0...

Caractéristiques physiographiques du territoire du parc naturel

], cependant, la définition des antioxydants en tant que composés chimiques ne donne pas une image complète des propriétés protectrices de l'objet étudié : elles sont déterminées non seulement par la quantité d'un antioxydant particulier, mais également par l'activité de chacun d'eux. L'activité antioxydante, ou activité antioxydante, AOA, est la constante de vitesse de la réaction d'un antioxydant avec un radical libre (kInH). La méthode de chimiluminescence (CL) vous permet de déterminer la quantité totale de radicaux qui lient les antioxydants dans un échantillon (capacité antioxydante totale, TAU), et lors de l'utilisation de la méthode de modélisation mathématique de la cinétique CL, également le taux de formation et de réaction des radicaux avec des antioxydants, c'est-à-dire AOA [, ,].

La modification la plus courante de la méthode de chimiluminescence pour déterminer la capacité antioxydante totale est basée sur l'utilisation du luminol comme activateur de chimiluminescence [, , ,]. Un échantillon est placé dans une cuvette de chimiluminomètre additionné de luminol, de peroxyde d'hydrogène et d'un composé capable de former des radicaux par décomposition spontanée (thermolyse), par exemple le dichlorhydrate de 2,2'-azobis-(2-amidinopropane) (ABAP ) : ABAP → 2R. En présence d'oxygène moléculaire, le radical alkyle R forme le radical peroxyle ROO : R + O 2 → ROO. Ensuite, le radical peroxyle oxyde la sonde chimiluminescente luminol (LH 2), et le radical luminol (LH) se forme : ROO + LH 2 → ROOH + LH. À partir de la LH, grâce à la formation de substances intermédiaires (hydroperoxyde de luminol et endoperoxyde de luminol), une molécule du produit final de l'oxydation du luminol, l'acide aminophtalique, se forme dans un état excité électroniquement, qui émet un photon, et par conséquent une chimiluminescence est observée. . L’intensité du CL est proportionnelle au taux de production de photons et elle-même est proportionnelle à la concentration stationnaire de LH dans le système. En interagissant avec les radicaux, les antioxydants interrompent la chaîne de transformations décrite et empêchent la formation d'un photon.

Les composés sensibles à la thermolyse ne sont pas la seule source possible de radicaux lors de l’analyse de la capacité antioxydante d’un échantillon par la méthode chimiluminescente. Les alternatives sont les systèmes peroxydase de raifort-peroxyde d'hydrogène [, ], hémine-peroxyde d'hydrogène, cytochrome Avec–cardiolipine–peroxyde d'hydrogène, etc. Le schéma réactionnel d'oxydation du luminol par les peroxydases est considéré dans les travaux de Cormier et al. .

Les courbes cinétiques CL de ces systèmes reflètent deux étapes de la réaction : l'étape d'intensité croissante de CL et l'étape de plateau ou de déclin progressif de la luminescence, lorsque l'intensité de CL est soit constante, soit diminue lentement. L'ouvrage décrit deux approches pour mesurer la capacité antioxydante totale qui prennent en compte cette caractéristique des courbes. La méthode TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) est basée sur la mesure de la période de latence du CL τ et peuvent être utilisés pour déterminer des antioxydants tels que le Trolox ou l'acide ascorbique : ils se caractérisent par une vitesse de réaction élevée et constante avec les radicaux et pour cette raison peuvent être appelés antioxydants puissants. Pendant la période de latence, leur oxydation complète se produit. La méthode TAR (Total Antioxidant Reactivity) mesure le degré d'extinction de la chimiluminescence q au plateau ou maximum de la courbe de chimiluminescence : formule, où I est l'intensité de la chimiluminescence sans antioxydant, et I 1 est l'intensité de CL en présence d'un antioxydant. Cette méthode est utilisée si le système contient principalement des antioxydants faibles avec de faibles constantes de vitesse d'interaction avec les radicaux - bien inférieures à la constante du luminol.

L'effet des antioxydants n'est pas seulement caractérisé par des indicateurs τ Et q. Comme le montrent les travaux [,], l'effet des antioxydants tels que l'acide urique dans le système hémine – H 2 O 2 –luminol ou le tocophérol, la rutine et la quercétine dans le système cytochrome Avec–cardiolipine–H 2 O 2 –luminol, caractérisé par une modification du taux d'augmentation maximal de la CL ( vmax). Comme le montrent les résultats de la modélisation mathématique de la cinétique, les valeurs des constantes de vitesse d'interaction de ces antioxydants avec les radicaux sont proches de la valeur de la constante du luminol, c'est pourquoi ces antioxydants peuvent être appelés antioxydants de force moyenne.

Si la matière étudiée, notamment les matières premières végétales, ne contenait qu'un seul type d'antioxydants, alors leur teneur pourrait être caractérisée par l'un des trois indicateurs listés ci-dessus ( τ , q ou vmax). Mais les matières végétales contiennent un mélange d’antioxydants de différentes forces. Pour résoudre ce problème, certains auteurs [ , , , ] ont utilisé la variation de la somme lumineuse de la chimiluminescence sur un certain temps ∆S, calculée par la formule , où ∆ S 0 et ∆ S S- Sommes légères CL pour un temps donné t dans les échantillons de contrôle et d’essai, respectivement. Le temps doit être suffisant pour que tous les antioxydants du système soient oxydés, c'est-à-dire pour que la courbe CL de l'échantillon testé atteigne le niveau de la courbe CL de l'échantillon témoin. Cette dernière suppose que les chercheurs doivent non seulement enregistrer la somme lumineuse de la lueur, mais également enregistrer la courbe cinétique CL pendant une durée suffisamment longue, ce qui n'est pas toujours fait.

Étant donné que tous les indicateurs mesurés dépendent de l'appareil et des conditions de mesure, l'effet antioxydant de la substance dans le système étudié est généralement comparé à l'effet d'un antioxydant pris comme standard, par exemple Trolox [,].

Le système peroxydase de raifort – peroxyde d’hydrogène a été utilisé pour analyser la capacité antioxydante totale des matières végétales par de nombreux auteurs. Dans les travaux [ , ], la période de latence du CL (méthode TRAP) a été utilisée pour estimer la quantité d'antioxydants dans les échantillons, et dans les travaux [ , , ] - l'aire sous la courbe de développement du CL. Cependant, les travaux répertoriés ne fournissent pas de justification claire pour le choix de l'un ou l'autre paramètre d'évaluation de l'OUA.

Le but de l'étude était de déterminer comment le rapport des différents types d'antioxydants affecte le TOA et de modifier la méthode de chimiluminescence de manière à pouvoir déterminer plus précisément le TOA dans les matières végétales. Pour ce faire, nous nous sommes fixés plusieurs tâches. Tout d’abord, comparez la cinétique CL des objets étudiés avec la cinétique des antioxydants standards de trois types (fort, moyen et faible) afin de comprendre quel type d’antioxydants apporte la principale contribution à l’OUA des objets étudiés. Deuxièmement, calculez l'OAE des objets étudiés en mesurant la diminution de la somme lumineuse CL sous l'influence de ces objets par rapport à l'effet de l'antioxydant qui apporte la plus grande contribution à l'OAE.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Les objets de l'étude étaient des échantillons industriels d'aubépine, de sorbier et d'églantier produits par JSC Krasnogorskleksredstva (Russie), ainsi que des fruits de framboise collectés par les auteurs dans la région de Moscou dans des conditions de croissance naturelles et séchés à une température de 60 à 80 °. C jusqu'à ce qu'ils arrêtent de libérer du jus et de se déformer lorsqu'ils sont pressés.

Les réactifs pour analyser la capacité antioxydante par la méthode chimioluminescente étaient : KH 2 PO 4, solution tampon 20 mM (pH 7,4) ; peroxydase de racines de raifort (activité 112 unités/mg, M = 44 173,9), solution aqueuse 1 mM ; luminol (5-amino-1,2,3,4-tétrahydro-1,4-phtalazinedione, hydrazide d'acide 3-aminophtalique, M = 177,11), solution aqueuse 1 mM ; peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2, M = 34,01), solution aqueuse 1 mM ; solutions d'antioxydants (acide ascorbique, quercétine, tocophérol). Tous les réactifs sont fabriqués par Sigma Aldrich (USA).

Des décoctions de fruits d'aubépine, de sorbier et d'églantier et une infusion de framboises ont été préparées selon les méthodes de la Pharmacopée d'État de l'URSS, énoncées dans l'article général de la pharmacopée « Infusions et décoctions ».

La détermination de la capacité antioxydante totale a été réalisée en enregistrant la chimiluminescence sur un chimiluminomètre Lum-100 (DISoft, Russie) à l'aide du logiciel PowerGraph 3.3. Pour déterminer l'OAE dans les matières végétales, 40 µl de luminol à la concentration de 1 mM, 40 µl de peroxydase de raifort à la concentration de 0,1 µM, de 10 à 50 µl de décoction ou d'infusion (selon la concentration) et du tampon phosphate dans le La quantité requise a été placée dans la cuvette de l'appareil pour porter le volume total de l'échantillon à 1 ml. La cuvette a été installée dans l'appareil et CL a été enregistrée en observant le signal de fond. Après 48 s d'enregistrement du signal de fond, 100 µl de H2O2 à une concentration de 1 mM ont été ajoutés à la cuvette et l'enregistrement CL a été poursuivi pendant 10 min. Quatre échantillons ont été préparés avec différentes concentrations de chaque objet végétal. CL a également été enregistrée pour les solutions d'acide ascorbique, de quercétine et de tocophérol à cinq concentrations différentes pour chaque antioxydant. Par la suite, l'OUA des échantillons de décoctions et d'infusions a été recalculée en quercétine.

Les concentrations de luminol, de peroxydase de raifort et de peroxyde d'hydrogène ont été sélectionnées de manière à déterminer la capacité antioxydante d'extraits aqueux de matières végétales médicinales dans un temps acceptable (pas plus de 10 min). Pendant ce temps, les courbes de chimiluminescence de l'ascorbate d'antioxydants et du flavonoïde quercétine (les principaux antioxydants des matières végétales) ont atteint un plateau, indiquant la destruction complète des antioxydants dans le système. Les dilutions des échantillons étudiés et les concentrations des solutions d'antioxydants standards (indiquées dans les légendes des figures) ont été sélectionnées de telle sorte que toutes les courbes cinétiques CL soient mesurées avec la même sensibilité de l'appareil.

La capacité antioxydante a été calculée à partir du changement de surface (∆ S) sous la courbe cinétique de chimiluminescence (somme légère) lors de l'ajout d'une substance contenant un antioxydant. Pour cela nous avons calculé S 0 pour un système sans antioxydant et en soustrayons la surface S S, caractérisant le système auquel l'antioxydant a été ajouté. Valeur ∆ S dépend de la sensibilité du chimiluminomètre et des conditions de mesure. Rapport ∆ S/CV(Où C- concentration du matériel biologique étudié dans la cuvette, g/l, et V- volume de la cuvette, l) exprime la capacité antioxydante de 1 g de la matière étudiée, c'est-à-dire les matières premières végétales.

La capacité antioxydante ∆ a été calculée de la même manière SA une solution d'un antioxydant standard, par exemple de la quercétine, placée dans le même volume du mélange réactionnel. Rapport ∆ S A /C A V(Où CALIFORNIE- concentration pondérale de l'antioxydant dans la cuvette, g/l) exprime la capacité antioxydante de 1 g d'antioxydant.

Pour chacun des antioxydants standards, le signal provenant de solutions de plusieurs concentrations a été enregistré pour garantir que les calculs se situaient dans une relation linéaire et que les résultats obtenus étaient reproductibles. En effet, une dépendance linéaire a été obtenue (∆ SA = k A C A) signal provenant de la concentration à partir de laquelle le coefficient stœchiométrique a été calculé kA. Selon le critère de Fisher, les valeurs obtenues pour les antioxydants standards kA statistiquement significatif avec une probabilité de 0,975. Ensuite, le signal de quatre concentrations a été enregistré pour chacun des quatre échantillons de plantes, et pour tous les échantillons, une dépendance linéaire du signal sur la concentration a été obtenue (∆ S = k·C), à partir duquel le coefficient stœchiométrique a été calculé k. Avec une probabilité de 0,975 (test de Fisher), les valeurs k obtenues pour les échantillons de plantes sont statistiquement significatives. La capacité antioxydante totale du matériel végétal en termes de masse de l'antioxydant standard (mg%) a été déterminée à l'aide de la formule.

Les valeurs ont été présentées sous forme de moyenne arithmétique ± écart type (M ± δ) à p

RÉSULTATS DE RECHERCHE

Etude de la cinétique de chimiluminescence en présence d'ascorbate de sodium (Fig. 1. Effet de l'ascorbate de sodium sur la cinétique de chimiluminescence" data-note="Concentrations des composants du système : luminol - 40 µM, peroxydase de raifort - 4 nM, peroxyde d'hydrogène - 100 µM Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 - 0,05 µM ; 3 - 0,15 µM ; 5 - 0,2 µM ascorbate de sodium. ">Fig. 1) a montré que pour cela, l'antioxydant est caractérisé par une période de latence pendant laquelle CL est presque complètement supprimé. Sa durée est proportionnelle à la quantité d'antioxydant dans le système. Dans le même temps, ni la pente des courbes CL ni l'intensité du CL sur le plateau ne changent. Cela s'explique par le fait que l'acide ascorbique est un acide fort. antioxydant qui intercepte tous les radicaux formés dans le système, y compris les radicaux luminol, et le CL ne se développe que lorsque tout l'ascorbate est oxydé.

D'autres chercheurs ont également montré que les résultats de l'analyse chimique et la valeur TAU déterminée par la méthode chimiluminescente ne coïncident souvent pas. Dans le cadre de ces travaux, la capacité antioxydante totale déterminée dans le système peroxydase-luminol-peroxyde d'hydrogène était en corrélation avec la teneur en composés triterpéniques. Cependant, dans les travaux des mêmes auteurs, dans lesquels l'objet d'étude était une autre plante, ils n'ont observé aucune corrélation entre l'OAE et le contenu d'un groupe de substances, y compris les flavonoïdes.

De tels écarts sont associés à au moins trois facteurs. Premièrement, l'activité des antioxydants est importante, c'est-à-dire le taux de leur interaction avec les radicaux, qui est différent selon les antioxydants inclus dans l'échantillon végétal. Selon Izmailov, les constantes de vitesse des réactions correspondantes pour le mexidol, le tocophérol et la quercétine sont corrélées à 0,04 : 2 : 60. Deuxièmement, chaque molécule antioxydante, entrant dans une réaction chimique, peut intercepter un nombre différent de radicaux. Selon les travaux, les acides quercétine, urique et ascorbique ont intercepté respectivement 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 et 0,5 ± 0,2 radicaux par molécule antioxydante ayant réagi (le système hémine-H 2 O 2 a été utilisé -luminol). Troisièmement, les résultats de l'étude pourraient être influencés par la présence d'activité peroxydase dans les échantillons de plantes eux-mêmes, comme dans les travaux, ainsi que par la présence de calcium dans les échantillons, qui, comme le montrent les travaux, est capable d'augmenter l'activité de la peroxydase de raifort dans certaines conditions. Cela provoque généralement une intensité CL plus élevée sur le plateau que sur les courbes de contrôle, ce que nous n'avons cependant pas observé.

Le premier facteur limite fortement l'utilisation d'un paramètre tel qu'une modification de la somme lumineuse, car le temps de mesure de la chimiluminescence doit être plus long que le temps de consommation de tous les antioxydants dans l'échantillon testé. L'occurrence de ce moment ne peut être jugée qu'en mesurant la cinétique de la chimiluminescence. De plus, la contribution des antioxydants faibles au TAU est fortement sous-estimée, car le temps nécessaire à leur oxydation complète est plusieurs fois plus long que la durée de mesure acceptable (10 à 20 minutes).

Le coefficient stœchiométrique de l'antioxydant est encore plus important. Nombre de radicaux n intercepté par celui-ci est égal à , où ρ est le coefficient stœchiométrique, et ∆ m- changement de concentration de l'antioxydant au cours de la mesure, dans notre cas - la concentration initiale de la substance à tester dans l'échantillon à tester.

La différence entre la somme lumineuse de la luminescence en l'absence d'un antioxydant et en sa présence est proportionnelle n. Le nombre total de radicaux interceptés est , où ρ je est le coefficient stœchiométrique d'un antioxydant spécifique, et je suis- sa concentration lors de la mesure. Le nombre total de radicaux interceptés n'est évidemment pas égal à la quantité totale d'antioxydants, puisque les coefficients ρ je non seulement ne sont pas égaux à l’unité, mais diffèrent également de manière significative selon les différents antioxydants.

Ordre de grandeur n est proportionnel à la différence des sommes légères mesurées pendant un certain temps entre un échantillon contenant un antioxydant et un échantillon témoin ne contenant pas d'antioxydant : S = k n, Où k- coefficient, constant dans les mêmes conditions de mesure.

La méthode discutée dans l'article nous permet de déterminer la capacité antioxydante totale, tandis que l'analyse chimique nous permet de déterminer la teneur totale en antioxydants du produit. La méthode de chimiluminescence semble donc plus informative que les analyses chimiques.

Les conditions que nous avons sélectionnées pour évaluer la capacité antioxydante totale des matières premières végétales en enregistrant la cinétique de chimiluminescence dans un système composé de peroxydase de raifort, de peroxyde d'hydrogène et de luminol (concentrations en composants - 4 nM, 100 µM et 40 µM, respectivement ; 20 mM de phosphate tampon, pH 7,4), assurait l'oxydation d'antioxydants forts (acide ascorbique) et d'antioxydants moyens (quercétine) en 10 minutes. Cette durée de mesure est pratique et garantit la qualité de mesure requise.

L'analyse de la cinétique de chimiluminescence a montré que dans les objets étudiés (décoctions de fruits de sorbier, d'églantier, d'aubépine et infusion de framboises) les principaux antioxydants sont des antioxydants de force moyenne, dont les flavonoïdes, et de faible force (tocophérol, etc.). Sur la base de la diminution de la somme lumineuse de la chimiluminescence, la capacité antioxydante totale des objets étudiés a été calculée. La comparaison des valeurs TAU obtenues avec les résultats de l'analyse chimique a montré que les produits contenant la même quantité d'antioxydants avec des ratios différents peuvent différer dans leur capacité à protéger efficacement l'organisme contre les effets nocifs des radicaux libres. La technique décrite est prometteuse pour étudier des objets végétaux contenant un mélange de divers antioxydants. En même temps, il se caractérise par la simplicité et le faible coût de la recherche. La combinaison de la mesure de la cinétique de chimiluminescence avec la modélisation mathématique des réactions automatisera non seulement le processus de détermination de la TAU, mais déterminera également la contribution de groupes individuels d'antioxydants à l'indicateur.

Antioxydants (AO)- des substances qui empêchent l'oxydation.

Dans un organisme vivant, le principal facteur d'oxydation est la formation de radicaux libres, c'est pourquoi l'action des antioxydants dans les systèmes biologiques est considérée principalement du point de vue de la prévention de l'oxydation des substances organiques par les radicaux libres.

Actuellement, il existe un grand nombre de méthodes différentes pour déterminer les antioxydants : photométriques, chimiques, électrochimiques, etc. Cependant, nombre d'entre elles présentent des inconvénients importants qui rendent difficile la compréhension et l'utilisation ultérieure des résultats obtenus par ces méthodes.
Les inconvénients les plus courants sont les suivants :

Des conditions artificielles ou inhabituelles pour les systèmes biologiques sont utilisées pour mesurer l’effet antioxydant.

Par exemple, au lieu de réactions biologiques radicalaires, des réactions redox purement chimiques sont utilisées ou la capacité d'une substance à donner/accepter des électrons lorsqu'elle est exposée à un courant électrique est mesurée. Les résultats de mesures obtenus dans de telles conditions ne permettent pas de dire si la substance étudiée présentera le même effet « antioxydant » sur l’organisme.

La détermination de l'effet antioxydant est effectuée en mesurant la quantité de produits d'oxydation accumulés (marqueurs d'oxydation). De cette manière, il est effectivement possible de déterminer la quantité d’antioxydant dans l’échantillon testé, mais des informations très importantes sur l’activité de l’antioxydant sont manquées.
Un avantage important de cette approche est la possibilité d'utiliser divers systèmes chimiques pour générer des radicaux libres, ce qui permet de mieux déterminer la spécificité des antioxydants et la localisation de leur action.
Mesurer les caractéristiques quantitatives et qualitatives des antioxydants- la méthode chimiluminescente permet de caractériser tout composé ayant un effet antioxydant par deux indicateurs indépendants :
- Capacité antioxydante (AOE)- la quantité totale de radicaux libres capables de neutraliser un composé contenu dans un échantillon d'un certain volume.
- Activité antioxydante (AOA)- le taux de neutralisation des radicaux libres, c'est-à-dire le nombre de radicaux neutralisés par unité de temps.

Par exemple, au lieu de réactions biologiques radicalaires, des réactions redox purement chimiques sont utilisées ou la capacité d'une substance à donner/accepter des électrons lorsqu'elle est exposée à un courant électrique est mesurée. donne une compréhension importante que l'effet des antioxydants doit être évalué par deux indicateurs - quantitatif (AOE) et qualitatif (AOA).
La figure suivante illustre cette situation :

Effet de différents antioxydants sur la chimiluminescence
(les chiffres à côté des graphiques indiquent la concentration en antioxydant) :
à gauche se trouve un antioxydant « fort », à droite un antioxydant « faible ».

Les antioxydants diffèrent considérablement dans leur activité. Il existe des antioxydants « forts », c'est-à-dire Antioxydants hautement actifs qui inhibent les radicaux libres à un rythme élevé et suppriment complètement la chimiluminescence. De tels antioxydants ont un effet maximal même à faibles concentrations et sont rapidement consommés.

D’un autre côté, il existe des antioxydants « faibles », c’est-à-dire Antioxydants de faible puissance qui inhibent les radicaux libres à un faible taux et n'inhibent que partiellement la chimiluminescence.

De tels antioxydants n'ont un effet significatif qu'à des concentrations élevées, mais en même temps, ils sont consommés lentement et agissent pendant une longue période.
La méthode chimiluminescente peut être utilisée pour déterminer des indicateurs antioxydants :
fluides biologiques (plasma, salive, urine) ;
médicaments pharmacologiques et compléments alimentaires;
boissons et additifs alimentaires;

produits cosmétiques et de soins;

et etc.
Pour mettre en œuvre la méthode chimioluminescente de dosage des antioxydants, il est recommandé d'utiliser le matériel suivant :

Chimiluminomètre Lum-100 - permet le contrôle de la température et l'enregistrement de la chimiluminescence d'un échantillon.

Chimiluminomètre Lum-1200 - permet le contrôle de la température et l'enregistrement simultané de la chimiluminescence pour jusqu'à 12 échantillons. Mots clés radical libre / capacité antioxydante totale / chimiluminescence/ luminol / radical libre / antioxydant / activité antioxydante / capacité antioxydante totale / chimiluminescence / luminol

annotation article scientifique sur les sciences chimiques, auteur de l'ouvrage scientifique - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu.

Les matières végétales médicinales sont l’une des sources d’antioxydants pour le corps humain. Parmi les méthodes permettant de déterminer la teneur en antioxydants des objets végétaux, la méthode d'analyse par chimiluminescence est très répandue. Dans ce travail, il a été utilisé pour estimer capacité antioxydante totale(OAE) décoctions de fruits de sorbier, d'églantier et d'aubépine et infusion de fruits de framboise. La cinétique a été enregistrée dans l'expérience chimiluminescence dans un système composé de peroxydase de raifort, de peroxyde d'hydrogène et de luminol. Les concentrations et le volume des composants du système dans l'échantillon ont été sélectionnés de manière à ce que les antioxydants forts (acide ascorbique) et modérés (quercétine) soient complètement oxydés pendant la durée de mesure (10 min). Une méthode de calcul de l'OAE basée sur l'évolution de la somme légère est proposée et justifiée chimiluminescence en présence d'échantillons de plantes. Analyse cinétique chimiluminescence ont montré que les objets étudiés étaient dominés par des antioxydants de force moyenne, dont les flavonoïdes, et des antioxydants faibles (tocophérol, etc.). Une comparaison des valeurs OAE calculées pour les objets étudiés et les données de leur analyse chimique ont montré que les produits contenant la même quantité d'antioxydants avec des ratios différents selon les types peuvent différer dans leur capacité à protéger l'organisme des effets nocifs des radicaux libres. . La technique décrite est prometteuse pour étudier des objets végétaux contenant un mélange d'antioxydants de différents types.

Rubriques connexes ouvrages scientifiques en sciences chimiques, auteur de l'ouvrage scientifique - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu.

2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Détermination des antioxydants par chimiluminescence activée au 2,2"-azo-bis(2-amidinopropane)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Effet antioxydant de la dihydroquercétine et de la rutine dans les réactions de peroxydase catalysées par le cytochrome c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Évaluation de la capacité oxydante et antioxydante de substrats biologiques par chimiluminescence induite par la réaction de Fenton
2016 / Piskarev Igor Mikhaïlovitch, I.P. Ivanova
Détermination de la teneur en lipohydroperoxydes des lipoprotéines sériques à l'aide du système microperoxydase-luminol
2011 / Teselkin Yuri Olegovich, Babenkova Irina Vladimirovna
Méthodes de recherche sur les antioxydants
2004 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V.
Activité antioxydante des plantes utilisées en ethnomédecine de Touva
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Etude des propriétés antioxydantes du Fosprenil dans divers systèmes de tests biologiques
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu Sanina, A. D. Agafonova.
L'influence de diverses doses de biphényles polychlorés sur l'état de chimioluminescence spontanée et induite par les immunoglobulines, dépendante du luminol, du sang total
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samokhodova O.V.
Évaluation du système de protection antioxydant par peroxydation lipidique chez les enfants souffrant d'hypertension artérielle essentielle à l'aide de méthodes de spectrophotométrie et de chimiluminescence
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Alexandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Détermination par chimiluminescence de la capacité antioxydante totale dans les matières végétales médicinales

Les matières végétales médicinales sont l’une des sources d’antioxydants pour le corps humain. L'analyse par chimiluminescence est l'une des méthodes courantes pour déterminer la teneur en antioxydants des matières végétales. Dans notre travail, l'analyse par chimiluminescence a été utilisée pour déterminer la capacité antioxydante totale (TAC) des décoctions de fruits de sorbier, de rose et d'aubépine, ainsi que de l'infusion de framboise. Des expériences ont établi la cinétique de la chimiluminescence d'un système composé de peroxydase de raifort, de peroxyde d'hydrogène et de luminol. Les concentrations et les volumes des composants du système ont été choisis de telle sorte que les antioxydants puissants (acide ascorbique) et les antioxydants de force moyenne (quercétine) soient complètement oxydés pendant la mesure (10 minutes). Une méthode de calcul du TAC basée sur les changements dans la somme de lumière de chimiluminescence en présence d'échantillons de plantes a été proposée et justifiée. L'analyse de la cinétique de chimiluminescence a montré que les antioxydants de force moyenne dominent dans les objets étudiés, notamment les flavonoïdes et les antioxydants faibles (tocophérol et autres). La comparaison des valeurs TAC calculées pour les objets étudiés et leurs données d'analyse chimique a montré que les produits contenant la même quantité d'antioxydants avec différents ratios d'antioxydants selon les types pouvaient varier dans leur capacité à protéger l'organisme contre les effets nocifs des radicaux libres. . La technique décrite est prometteuse pour l’étude d’objets végétaux contenant un mélange de différents types d’antioxydants.

Texte d'un travail scientifique sur le thème « Méthode chimiluminescente pour déterminer la capacité antioxydante totale des matières végétales médicinales »

procédé chimioluminescent pour déterminer la capacité antioxydante totale de matières végétales médicinales

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu.

1Département de biophysique médicale, Faculté de médecine fondamentale, Université d'État M.V. Lomonossov de Moscou, Moscou

2 Département de Pharmacognosie, Faculté de Pharmacie,

Première Université médicale d'État de Moscou nommée d'après I.M. Sechenov, Moscou

Les matières végétales médicinales sont l’une des sources d’antioxydants pour le corps humain. Parmi les méthodes permettant de déterminer la teneur en antioxydants des objets végétaux, la méthode d'analyse par chimiluminescence est très répandue. Dans ce travail, il a été utilisé pour évaluer la capacité antioxydante totale (TAC) de décoctions de fruits de sorbier, d'églantier et d'aubépine et d'infusion de fruits de framboise. Dans l'expérience, la cinétique de chimiluminescence a été enregistrée dans un système composé de peroxydase de raifort, de peroxyde d'hydrogène et de luminol. Les concentrations et le volume des composants du système dans l'échantillon ont été sélectionnés de manière à ce que les antioxydants forts (acide ascorbique) et modérés (quercétine) soient complètement oxydés pendant la durée de mesure (10 min). Une méthode de calcul de l'OAE basée sur les modifications de la somme légère de chimiluminescence en présence d'échantillons de plantes a été proposée et justifiée. L'analyse de la cinétique de chimiluminescence a montré que les antioxydants de force moyenne, dont les flavonoïdes, et les antioxydants faibles (tocophérol, etc.) prédominent dans les objets étudiés. Une comparaison des valeurs OAE calculées pour les objets étudiés et les données de leur analyse chimique ont montré que les produits contenant la même quantité d'antioxydants avec des ratios différents selon les types peuvent différer dans leur capacité à protéger l'organisme des effets nocifs des radicaux libres. . La technique décrite est prometteuse pour étudier des objets végétaux contenant un mélange d'antioxydants de différents types.

Mots clés : radical libre, antioxydant, activité antioxydante, capacité antioxydante totale, chimiluminescence, luminol

Financement : les travaux ont été soutenus par la Fondation russe pour la science, subvention n° 14-15-00375.

Ex3 Pour correspondance : Georgy Konstantinovitch Vladimirov

119192, Moscou, Lomonosovsky pr-t, 31, bâtiment 5 ; [email protégé]

Article reçu : 10/03/2016 Article accepté pour publication : 18/03/2016

détermination par chimiluminescence de la capacité antioxydante totale d'une matière végétale médicinale

1 Département de biophysique médicale, Faculté de médecine fondamentale, Université d'État Lomonossov de Moscou, Moscou, Russie

2 Département de Pharmacognosie, Faculté de Pharmacie,

La première Université médicale d'État Sechenov de Moscou, Moscou, Russie

Mots clés : radical libre, antioxydant, activité antioxydante, capacité antioxydante totale, chimiluminescence, luminol

Financement : ce travail a été soutenu par la Fondation russe pour la science, subvention no. 14-15-00375.

Remerciements : les auteurs remercient Andrey Alekseev de l'Université d'État Lomonossov de Moscou pour son aide dans la conduite de l'expérience. La correspondance doit être adressée à : Georgiy Vladimirov

Perspective Lomonosovskiy, d. 31, k. 5, Moscou, Russie, 119192 ; [email protégé] Reçu : 10/03/2016 Accepté : 18/03/2016

Les radicaux libres formés dans le corps perturbent la structure des membranes cellulaires, ce qui conduit au développement de diverses conditions pathologiques. Les effets oxydatifs destructeurs des radicaux sont prévenus par le système de défense antioxydant de l'organisme, dans lequel un rôle important est joué par des composés de faible poids moléculaire - les intercepteurs de radicaux (pièges). L'une des sources d'antioxydants sont les matières végétales médicinales, ainsi que les médicaments à base de celles-ci, dont l'étude du potentiel antioxydant contribue à augmenter leur effet préventif et thérapeutique.

Les principales méthodes de détermination des antioxydants sont discutées dans les ouvrages, cependant, la définition des antioxydants en tant que composés chimiques ne donne pas une image complète des propriétés protectrices de l'objet étudié : elles sont déterminées non seulement par la quantité d'un antioxydant particulier, mais aussi par l'activité de chacun d'eux. L'activité antioxydante, ou activité antioxydante, AOA, est la constante de vitesse de la réaction d'un antioxydant avec un radical libre (kInH). La méthode de chimiluminescence (CL) permet de déterminer la quantité totale de radicaux qui se lient aux antioxydants dans un échantillon (capacité antioxydante totale, TCA), et lors de l'utilisation de la méthode de modélisation mathématique de la cinétique du CL, également le taux de formation et de réaction de radicaux avec des antioxydants, c'est-à-dire AOA.

La modification la plus courante de la méthode de chimiluminescence pour déterminer la capacité antioxydante totale repose sur l’utilisation du luminol comme activateur de chimiluminescence. Un échantillon est placé dans une cuvette de chimiluminomètre additionné de luminol, de peroxyde d'hydrogène et d'un composé capable de former des radicaux par décomposition spontanée (thermolyse), par exemple le dichlorhydrate de 2,2"-azobis-(2-amidinopropane) (ABAP ) :

En présence d'oxygène moléculaire, le radical alkyle R^ forme le radical peroxyle ROO^ :

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv À partir de LH, grâce à la formation de substances intermédiaires (hydroperoxyde de luminol et endoperoxyde de luminol), une molécule du produit final de l'oxydation du luminol, l'acide aminophtalique, se forme dans un état excité électroniquement, qui émet un photon , et par conséquent une chimiluminescence est observée . L’intensité du CL est proportionnelle au taux de production de photons et elle-même est proportionnelle à la concentration stationnaire de LH dans le système. En interagissant avec les radicaux, les antioxydants interrompent la chaîne de transformations décrite et empêchent la formation d'un photon.

Les composés sensibles à la thermolyse ne sont pas la seule source possible de radicaux lors de l’analyse de la capacité antioxydante d’un échantillon par la méthode chimiluminescente. Les alternatives sont la peroxydase de raifort-peroxyde d'hydrogène, l'hémine-peroxyde d'hydrogène, le cytochrome c-cardiolipine-peroxyde d'hydrogène, etc. Le schéma réactionnel pour l'oxydation du luminol par les peroxydases est discuté dans les travaux de Cormier et al. .

Les courbes cinétiques CL de ces systèmes reflètent deux étapes de la réaction : l'étape d'augmentation de l'intensité CL et l'étape d'un plateau ou d'un déclin progressif de la luminescence, lorsque

L’intensité du CL est soit constante, soit diminue lentement. L'ouvrage décrit deux approches pour mesurer la capacité antioxydante totale qui prennent en compte cette caractéristique des courbes. La méthode TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) est basée sur la mesure de la période de latence du CL t et peut être utilisée pour déterminer des antioxydants tels que le Trolox ou l'acide ascorbique : ils se caractérisent par une vitesse de réaction constante élevée avec les radicaux et pour cette raison peuvent être appelés antioxydants puissants. Pendant la période de latence, leur oxydation complète se produit. La méthode TAR (Total Antioxidant Reactivity) mesure le degré d'extinction de chimiluminescence q au plateau ou maximum de la courbe de chimiluminescence :

où I est l'intensité de la chimiluminescence sans antioxydant et 11 est l'intensité CL en présence d'un antioxydant. Cette méthode est utilisée si le système contient principalement des antioxydants faibles avec de faibles constantes de vitesse d'interaction avec les radicaux - bien inférieures à la constante du luminol.

L'effet des antioxydants n'est pas seulement caractérisé par les indicateurs t et c. Comme le montrent les travaux, l'effet des antioxydants tels que l'acide urique dans le système hémine-H2O2-luminol ou le tocophérol, la rutine et la quercétine dans le système cytochrome c-cardiolipine-H2O2-luminol se caractérise par une modification du taux maximum d’augmentation du CL (utx). Comme le montrent les résultats de la modélisation mathématique de la cinétique, les valeurs des constantes de vitesse d'interaction de ces antioxydants avec les radicaux sont proches de la valeur de la constante du luminol, c'est pourquoi ces antioxydants peuvent être appelés antioxydants de force moyenne.

DE = DE0 - DE,

où DE0 et DE5 sont les sommes de lumière CL pour un temps donné ? dans les échantillons de contrôle et d’essai, respectivement. Le temps doit être suffisant pour que tous les antioxydants du système soient oxydés, c'est-à-dire pour que la courbe CL de l'échantillon testé atteigne le niveau de la courbe CL de l'échantillon témoin. Cette dernière suppose que les chercheurs doivent non seulement enregistrer la somme lumineuse de la lueur, mais également enregistrer la courbe cinétique CL pendant une durée suffisamment longue, ce qui n'est pas toujours fait.

Étant donné que tous les paramètres mesurés dépendent de l'appareil et des conditions de mesure, l'effet antioxydant de la substance dans le système étudié est généralement comparé à l'effet d'un antioxydant standard, par exemple Trolox.

Le système peroxydase de raifort-peroxyde d’hydrogène a été utilisé par de nombreux auteurs pour analyser la capacité antioxydante totale des matières végétales. Pour estimer la quantité d'antioxydants dans les échantillons, la période de latence du CL (méthode TRAP) a été utilisée et l'aire sous la courbe de développement du CL a été utilisée dans les travaux. Cependant, les travaux répertoriés ne fournissent pas de justification claire

le choix de l'un ou l'autre paramètre d'évaluation de l'OUA.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Les objets de l'étude étaient des échantillons industriels d'aubépine, de sorbier et d'églantier produits par JSC Krasnogorskleksredstva (Russie), ainsi que des fruits de framboise collectés par les auteurs dans la région de Moscou dans des conditions de croissance naturelles et séchés à une température de 60-80° C jusqu'à ce qu'ils arrêtent de libérer du jus et de se déformer lorsqu'ils sont pressés.

Les réactifs pour analyser la capacité antioxydante par la méthode chimioluminescente étaient : KH2PO4, solution tampon 20 mM (pH 7,4) ; peroxydase de racines de raifort (activité 112 unités/mg, M = 44 173,9), solution aqueuse 1 mM ; luminol (5-amino-1,2,3,4-tétrahydro-1,4-phtalazinedione, hydrazide d'acide 3-aminophtalique, M = 177,11), solution aqueuse 1 mM ; peroxyde d'hydrogène (H2O2, M = 34,01), solution aqueuse 1 mM ; solutions d'antioxydants (acide ascorbique, quercétine, tocophérol). Tous les réactifs sont fabriqués par Sigma Aldrich (USA).

La détermination de la capacité antioxydante totale a été réalisée en enregistrant la chimiluminescence sur un chimiluminomètre Lum-100 (DISoft, Russie) à l'aide du logiciel PowerGraph 3.3. Pour déterminer l'OAE dans les matières végétales, 40 µl de luminol à la concentration de 1 mM, 40 µl de peroxydase de raifort à la concentration de 0,1 µM, de 10 à 50 µl de décoction ou d'infusion (selon la concentration) et du tampon phosphate dans le La quantité requise a été placée dans la cuvette de l'appareil pour porter le volume total de l'échantillon à 1 ml. La cuvette a été installée dans l'appareil et CL a été enregistrée en observant le signal de fond. Après 48 s d'enregistrement du signal de fond, 100 µl de H2O2 à une concentration de 1 mM ont été ajoutés à la cuvette et l'enregistrement CL a été poursuivi pendant 10 min. Quatre échantillons ont été préparés avec différentes concentrations de chaque objet végétal. CL a également été enregistrée pour les solutions d'acide ascorbique, de quercétine et de tocophérol à cinq concentrations différentes pour chacun des antioxydants. Par la suite, l'OUA des échantillons de décoctions et d'infusions a été recalculée en quercétine.

atteint un plateau, indiquant la destruction complète des antioxydants dans le système. Les dilutions des échantillons étudiés et les concentrations des solutions d'antioxydants standards (indiquées dans les légendes des figures) ont été sélectionnées de telle sorte que toutes les courbes cinétiques CL soient mesurées avec la même sensibilité de l'appareil.

La capacité antioxydante a été calculée à partir de la variation de l'aire (AS) sous la courbe cinétique de chimiluminescence (somme légère) lors de l'ajout d'une substance contenant un antioxydant. Pour ce faire, nous avons calculé S0 pour un système sans antioxydant et en avons soustrait l'aire SS, qui caractérise le système auquel l'antioxydant a été ajouté. La valeur de AS dépend de la sensibilité du chimiluminomètre et des conditions de mesure. Le rapport AS/C ■ V (où C est la concentration du matériel biologique étudié dans la cuvette, g/l, et V est le volume de la cuvette, l) exprime la capacité antioxydante de 1 g du matériel étudié, c'est-à-dire les matières premières végétales.

De manière similaire, nous avons calculé la capacité antioxydante ASa d'une solution d'un antioxydant standard, par exemple la quercétine, placée dans le même volume du mélange réactionnel. Le rapport AS/CÄ ■ V (où CA est la concentration pondérale de l'antioxydant dans la cuvette, g/l) exprime la capacité antioxydante de 1 g d'antioxydant.

Pour chacun des antioxydants standards, le signal provenant de solutions de plusieurs concentrations a été enregistré pour garantir que les calculs se situaient dans une relation linéaire et que les résultats obtenus étaient reproductibles. En effet, une dépendance linéaire (ASa = kA ■ CA) du signal sur la concentration a été obtenue, à partir de laquelle le coefficient stoechiométrique kA a été calculé. Selon le critère de Fisher, les valeurs kA obtenues pour les antioxydants standards sont statistiquement significatives avec une probabilité de 0,975. Ensuite, le signal de quatre concentrations a été enregistré pour chacun des quatre échantillons de plantes et, pour tous les échantillons, une dépendance linéaire du signal sur la concentration a été obtenue (AS = k ■ C), à partir de laquelle le coefficient stoechiométrique k a été calculé. Avec une probabilité de 0,975 (test de Fisher), les valeurs k obtenues pour les échantillons de plantes sont statistiquement significatives. La capacité antioxydante totale du matériel végétal en termes de masse de l'antioxydant standard (mg%) a été déterminée à l'aide de la formule

OEA = k ■ 105. k

Les valeurs ont été présentées sous forme de moyenne arithmétique ± écart type (M ± 5) à p<0,05.

RÉSULTATS DE RECHERCHE

Une étude de la cinétique de chimiluminescence en présence d'ascorbate de sodium (Fig. 1) a montré que cet antioxydant se caractérise par une période de latence pendant laquelle la CL est presque totalement supprimée. Sa durée est proportionnelle à la quantité d'antioxydant dans le système. Dans ce cas, ni la pente des courbes CL ni l'intensité CL sur le plateau ne changent. Cela s'explique par le fait que l'acide ascorbique est un antioxydant puissant qui intercepte tous les radicaux formés dans le système, y compris les radicaux luminol, et que le CL ne se développe que lorsque tout l'ascorbate est oxydé.

L'effet du tocophérol (Fig. 2) s'est manifesté par une diminution de l'intensité du CL sur le plateau, typique des antioxydants faibles, bien que le tocophérol soit considéré comme l'un des plus

de puissants antioxydants. Cette divergence est peut-être due au fait que dans notre expérience, les radicaux libres se trouvaient dans une solution aqueuse, alors que l'effet du tocophérol est généralement étudié dans des milieux non polaires. Dans une étude où la source de radicaux était un complexe de cytochrome c avec de la cardiolipine et où la réaction avec le luminol avait lieu au sein de ce complexe, le tocophérol avait les propriétés d'un antioxydant de force moyenne.

Après avoir étudié l'effet de diverses concentrations de quercétine sur notre système (Fig. 3) et comparé ses courbes cinétiques avec celles de l'ascorbate de sodium et du tocophérol, on peut noter que l'effet principal de la quercétine se manifeste par un changement de la pente de la courbes, c'est-à-dire le taux de développement de CL, typique des antioxydants de force moyenne.

Les courbes CL de toutes les décoctions étudiées (Fig. 4) ressemblent aux courbes de la quercétine avec une légère diminution de l'intensité CL à la fin, c'est-à-dire lorsqu'on atteint

Temps, minutes

Riz. 1. Effet de l'ascorbate de sodium sur la cinétique de chimiluminescence

Concentrations des composants du système : luminol - 40 µM, peroxydase de raifort - 4 nM, peroxyde d'hydrogène - 100 µM. Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,05 µM ; 3 à 0,10 µM ; 4 à 0,15 µM ; 5 à 0,2 µM ; 6 à 0,25 µM d’ascorbate de sodium.

plateau. Comme le montrent les travaux, ce comportement est typique des antioxydants de force moyenne, qui comprennent dans notre cas des polyphénols - flavonoïdes et tanins. Pour l'infusion de framboises (Fig. 4, D), on observe une diminution notable de la chimiluminescence au niveau du plateau, typique des antioxydants faibles, qui sont dans ce cas le tocophérol. En termes de quercétine et de tocophérol, l'infusion de framboise contient 4,7 ± 0,9 µmol/g de quercétine et 11,9 ± 0,8 µmol/g de tocophérol.

En comparant les courbes de chimiluminescence obtenues pour différentes concentrations des quatre extraits aqueux étudiés de matières végétales, il a été montré que la contribution des antioxydants moyens et faibles à la capacité antioxydante totale des échantillons diminuait dans la série suivante : infusion de framboise (Fig. 4 , D), décoction d'églantier (Fig. 4, B), décoction de fruits de sorbier (Fig. 4, A), décoction de fruits d'aubépine (Fig. 4, B). Les valeurs AS basées sur la concentration C de la substance étudiée dans la cuvette et les valeurs de la capacité antioxydante totale en termes de quercétine sont indiquées dans le tableau.

LA DISCUSSION DES RÉSULTATS

Les données obtenues au cours des expériences et les valeurs OAE des objets étudiés calculées sur cette base ont été comparées à la teneur en principaux antioxydants qu'ils contiennent, déterminée à l'aide de méthodes d'analyse chimiques. Malgré le fait que la corrélation positive entre la quantité totale d'antioxydants et de TAU dans différents objets soit indéniable, il existe encore des différences notables entre ces indicateurs. Par exemple, si l'on prend la somme de la teneur en flavonoïdes, tanins et acide ascorbique, alors elle s'avère supérieure au TAU calculé pour tous les objets étudiés, à l'exception de la décoction de fruits d'aubépine (tableau).

D'autres chercheurs ont également montré que les résultats de l'analyse chimique et la valeur TAU déterminée par la méthode chimiluminescente ne coïncident souvent pas. En fonctionnement, la capacité antioxydante totale, déterminée

46 Temps, minutes

Je" "h chi----.

Riz. 2. Effet du tocophérol sur la cinétique de chimiluminescence

Concentrations des composants du système : luminol - 40 µM, peroxydase de raifort - 4 nM, peroxyde d'hydrogène - 100 µM. Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,01 µM ; 3 à 0,025 µM ; 4 à 0,06 µM ; 5 à 0,1 µM ; 6 - 0,2 µM de tocophérol.

46 Temps, minutes

Riz. 3. Effet de la quercétine sur la cinétique de chimiluminescence Concentrations des composants du système : luminol - 40 µM, peroxydase de raifort - 4 nM, peroxyde d'hydrogène - 100 µM. Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,02 µM ; 3 à 0,03 µM ; 4 à 0,04 µM ; 5 à 0,05 µM ; 6 à 0,06 µM de quercétine.

Temps, minutes

46 Temps, minutes

120 je 100 80\60 40 20

46 Temps, minutes

Riz. 4. Effet des décoctions de fruits de sorbier (A), d'aubépine (B), d'églantier (C) et d'infusion de fruits de framboise (D) sur la cinétique de chimiluminescence Concentrations des composants du système : luminol - 40 µM, peroxydase de raifort - 4. nM, peroxyde d'hydrogène - 100 µM . (A) Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,002 g/litre ; 3 à 0,004 g/litre ; 4 à 0,006 g/l ; 5 - 0,008 g/l de décoction de fruits de sorbier. (B) Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,005 g/litre ; 3 à 0,0075 g/l ; 4 à 0,01 g/l ; 5 - 0,0125 g/l de décoction de fruits d'aubépine. (B) Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,001 g/l ; 3 à 0,0015 g/litre ; 4 à 0,002 g/litre ; 5 - 0,0025 g/l de décoction d'églantier. (D) Courbes : 1 - échantillon témoin ; 2 à 0,001 g/l ; 3 à 0,003 g/l ; 4 à 0,004 g/litre ; 5 - 0,005 g/l d'infusion de framboise.

dans le système peroxydase-luminol-peroxyde d'hydrogène en corrélation avec la teneur en composés triterpéniques. Cependant, dans les travaux des mêmes auteurs, dans lesquels l'objet d'étude était une autre plante, ils n'ont observé aucune corrélation entre l'OAE et le contenu d'un groupe de substances, y compris les flavonoïdes.

De tels écarts sont associés à au moins trois facteurs. Premièrement, l'activité des antioxydants est importante, c'est-à-dire le taux de leur interaction avec les radicaux, qui est différent selon les antioxydants inclus dans l'échantillon végétal. Selon Izmailov, les constantes de vitesse des réactions correspondantes pour le mexidol, le tocophérol et la quercétine sont corrélées à 0,04 : 2 : 60. Deuxièmement, chaque molécule antioxydante, entrant dans une réaction chimique, peut intercepter un nombre différent de radicaux. Selon les travaux, les acides quercétine, urique et ascorbique ont intercepté respectivement 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 et 0,5 ± 0,2 radicaux par molécule antioxydante ayant réagi (le système hémine-H2O2-luminol a été utilisé). Troisièmement, les résultats de l'étude pourraient être influencés par la présence d'activité peroxydase dans les échantillons de plantes eux-mêmes, comme dans les travaux, ainsi que par la présence de calcium dans les échantillons, qui, comme le montrent les travaux, est capable d'augmenter l'activité de la peroxydase de raifort dans certaines conditions. Cela conduit généralement à plus

intensité CL plus élevée sur le plateau que sur les courbes de contrôle, ce que nous n'avons cependant pas observé.

Le coefficient stœchiométrique de l'antioxydant est encore plus important. Le nombre de radicaux n interceptés par celui-ci est égal à

où p est le coefficient stoechiométrique et Am est la variation de la concentration de l'antioxydant pendant la durée de mesure, dans notre cas, la concentration initiale de la substance d'essai dans l'échantillon d'essai.

La différence de somme lumineuse de la luminescence en l'absence de l'antioxydant et en sa présence est proportionnelle à n. Le nombre total de radicaux interceptés est égal à n = Y.p. moi,

où est le coefficient stoechiométrique d'un antioxydant particulier et m est sa concentration lors de la mesure

Objet d'étude Flavonoïdes, mg%* Tanins, mg%* Acide ascorbique, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. unités TAU, mg% quercétine

Décoction de fruit de Rowan 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Décoction d'églantier 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Décoction de fruits d'aubépine 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infusion de framboises séchées 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Remarque : * - données de la littérature, . AS - changement de somme légère pour l'échantillon, rel. unités, C - concentration de l'échantillon dans la cuvette, g/l. Les valeurs calculées sont fiables à p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rhénia. Le nombre total de radicaux interceptés n'est évidemment pas égal à la quantité totale d'antioxydants, puisque non seulement les coefficients pt ne sont pas égaux à l'unité, mais diffèrent également de manière significative pour différents antioxydants.

La valeur de n est proportionnelle à la différence des sommes lumineuses mesurées pendant un certain temps entre un échantillon contenant un antioxydant et un échantillon témoin ne contenant pas d'antioxydant :

où k est un coefficient constant dans les mêmes conditions de mesure.

Nous avons sélectionné les conditions d'évaluation de la capacité antioxydante totale des matières premières végétales en enregistrant la cinétique de chimiluminescence dans un système composé de peroxydase de raifort, de peroxyde d'hydrogène et de luminol (concentrations en composants - 4 nM, 100 µM et 40 µM, respectivement ; 20 mM de phosphate tampon, pH 7,4 ),

assurait l'oxydation d'antioxydants forts (acide ascorbique) et d'antioxydants de force moyenne (quercétine) en 10 minutes. Cette durée de mesure est pratique et garantit la qualité de mesure requise.

L'analyse de la cinétique de chimiluminescence a montré que dans les objets étudiés (décoctions de fruits de sorbier, d'églantier, d'aubépine et infusion de framboises) les principaux antioxydants sont des antioxydants de force moyenne, dont les flavonoïdes, et de faible force (tocophérol, etc.). Sur la base de la diminution de la somme lumineuse de la chimiluminescence, la capacité antioxydante totale des objets étudiés a été calculée. Une comparaison des valeurs TAU obtenues avec les résultats de l'analyse chimique a montré que les produits contenant la même quantité d'antioxydants avec des ratios différents peuvent différer dans leur capacité à protéger efficacement l'organisme contre les effets nocifs des radicaux libres. La technique décrite est prometteuse pour étudier des objets végétaux contenant un mélange de divers antioxydants. En même temps, il se caractérise par la simplicité et le faible coût de la recherche. La combinaison de la mesure de la cinétique de chimiluminescence avec la modélisation mathématique des réactions automatisera non seulement le processus de détermination de la TAU, mais déterminera également la contribution de groupes individuels d'antioxydants à l'indicateur.

Littérature

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. Les radicaux libres en tant que participants aux processus régulateurs et pathologiques. Dans : Grigoriev A.I., Vladimirov Yu.A., éditeurs. Sciences fondamentales - médecine. Biophysique. Miel. technologie. M. : Presse MAX ; 2015. vol. 1. p. 38-71.

3. Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V. Méthodes d'étude des antioxydants. Chimique. rassasié. matières premières. 2004 ; (3) : 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Butovska D. I., Trofimov A. V. Activité antioxydante des chalcones. Détermination chimiluminescente de la réactivité et calcul chimique quantique des énergies et des structures des réactifs et intermédiaires. Cinétique et catalyse. 2010 ; 51 (4) : 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

chimiluminescence à médiation radicale : diversité mécanistique et principes fondamentaux du dosage des antioxydants. Arkivoc. 2007 ; 8 : 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Évaluation de la capacité antiradicalaire par chimiluminescence du luminol induite par H2O2-hémine. J Agric Food Chem. 3 décembre 2003 ; 51 (25) : 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Radicaux libres et chimiluminescence cellulaire. Uspekhi biol. chimie. 2009 ; 49 : 341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. La chimiluminescence cinétique comme méthode d'étude des réactions des radicaux libres. Biophysique. 2011 ; 56 (6) : 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. Détermination de l'activité antioxydante en mesurant la cinétique de chimiluminescence. Photobiologie et photomédecine. 2011 ; 7 (2) : 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescence du Luminol induite par thermolyse du 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropane).

Radic Res Commun. 1992 ; 17 (5) : 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Sur l'utilisation de l'extinction de la luminescence du luminol pour évaluer l'activité de la SOD. Radics Libres Biol Med. juin 1994 ; 16 (6) : 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Évaluation du potentiel antioxydant total (TRAP) et de la réactivité antioxydante totale à partir de mesures de chimiluminescence améliorées par le luminol. Radics Libres Biol Med. février 1995 ; 18 (2) : 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Une étude du mécanisme de la peroxydation luminescente du luminol par des techniques à flux arrêté. J Biol Chem. 25 septembre 1968 ; 243 (18) : 4706-14.

21. Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A. Détermination des antioxydants par chimiluminescence activée à l'aide de 2,2"-azo-bis(2-amidinopropane). Vestn. MGU. Ser. 2. Chem 2012;53(3) : 187-93.

24. Ministère de la Santé de l'URSS Pharmacopée d'État de l'URSS XI éd. Vol. 2 « Méthodes générales d'analyse. Matières premières végétales médicinales. M. : Médecine ; 1987. p. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Étude des préparations pour l'extraction d'églantier. Pharmacie. 2012 ; (2) : 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Étude des fruits d'aubépine à l'aide de diverses méthodes de conservation et d'extraction aqueuse. Pharmacie. 2010 ; (5) : 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya V. Substances biologiquement actives de fruits et extraits aqueux de framboise commune. Pharmacie. 2014 ; (1) : 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Étude des substances biologiquement actives des fruits d'aubépine - matières premières pour la préparation de teintures matricielles homéopathiques. Sur SAT. scientifique tr. basé sur des matériaux du XXIV Moscou. international homéopathe. conf. « Développement de la méthode homéopathique dans la médecine moderne » ; 24 et 25 janvier 2014 ; Moscou. M. ; 2014. p. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Étude de la composition des substances biologiquement actives dans les matières premières végétales médicinales de diverses méthodes de conservation. Sur SAT. thèses basées sur des matériaux de XX Ross. national congr. « L'homme et la médecine » ; 15-19 avril 2013 ; Moscou. M. : EKOOnis ; 2013. p. 184-90.

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Étude de l'activité peroxydase dans des extraits de rhizomes et de racines de raifort et de sa stabilité face à diverses influences. Vestn. Université d'Etat de Moscou. Ser. 2. Chim. 2006 ; 47 (5) : 350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. Dans : Grigor"ev AI, Vladimirov YuA, éditeurs. Fondamental"nye nauki - medicitsine. Biofizicheskie meditsinskie tekhnologii. Moscou : MAKS Press ; 2015. v. 1.p. 38-71. Russe.

2. Chanda S, Dave R. Modèles in vitro pour l'évaluation de l'activité antioxydante et certaines plantes médicinales possédant des propriétés antioxydantes : un aperçu. Afr J Microbiol Res. décembre 2009 ; 3 (13) : 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal"tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel"nogo Syr"ja. 2004; (3) : 63-75. Russe.

4. Vasil"ev RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya réactifs et intermédiaires. Cinétique et catalyse. 2010 ; 51 (4) : 533-41. Russe.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA et al. Potentiel antioxydant des composés liés à la curcumine étudié par cinétique de chimiluminescence, efficacité de rupture de chaîne, activité de récupération (ORAC) et calculs DFT. Beilstein J Org Chem. 11 août 2015 ; 11 : 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Chimiluminescence à médiation peroxy-radicalaire : diversité mécanistique et principes fondamentaux du test d'antioxydants. Arkivoc. 2007 ; 8 : 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil"ev RF. Test de chimiluminescence facile pour les propriétés antioxydantes des lipides végétaux : principes fondamentaux et exemples illustratifs. Analyste. Octobre 2009 ; 134 (10) : 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Évaluation de la capacité antiradicalaire du luminol induit par H2O2-hémine

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Svobodnye radikaly et kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009 ; 49 : 341-88. Russe.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya kak metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. Biophysique. 2011 ; 56 (6) : 1081-90. Russe.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologie et photographie. 2011 ; 7 (2) : 70-6. Russe.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescence du luminol induite par la thermolyse du 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropane). Free Radic Res Commun. 1992 ; 17 (5) : 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Sur l'utilisation de l'extinction de la luminescence du luminol pour évaluer l'activité de la SOD. Radics Libres Biol Med. juin 1994 ; 16 (6) : 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Chimiluminescence visible associée à la réaction entre la méthémoglobine ou l'oxyhémoglobine avec le peroxyde d'hydrogène. Photochem Photobiol. novembre 1994 ; 60 (5) : 405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV et al. Évaluation in vitro de l'activité antioxydante des flavonols liposomaux par le système HRP-H2O2-luminol. J Microencapsule. 2011 ; 28 (4) : 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Une enquête sur le mécanisme

de la peroxydation luminescente du luminol par des techniques à flux arrêté. J Biol Chem. 25 septembre 1968 ; 243 (18) : 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Caractéristiques phytochimiques, activités de piégeage des radicaux libres et neuroprotection de cinq extraits de plantes médicinales. Complément à base d'Evid Alternat Med. 2012 ; 2012 : 984295. est ce que je : 10.1155/2012/984295. Publication en ligne le 10 août 2011.

19. Chang CL, Lin CS. Composition phytochimique, activité antioxydante et effet neuroprotecteur des extraits de Terminalia chebula Retzius. Complément à base d'Evid Alternat Med. 2012 ; 2012 : 125247. est ce que je : 10.1155/2012/125247. Publication en ligne le 5 juillet 2011.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Évaluation de l'activité antioxydante de différents flavonoïdes par la méthode de chimiluminescence. AAPS PharmSci. 2003 ; 5 (2) : 111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov methoddom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol"zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Bulletin de chimie de l'Université de Moscou. 2012 ; 53 (3) : 187-93. Russe.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Application d'un test de chimiluminescence optimisé pour la détermination de la capacité antioxydante des extraits de plantes. Luminescence. 2012 novembre-décembre ; 27 (6) : 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Antioxydants totaux de faible poids moléculaire comme paramètre récapitulatif, quantifiés dans des échantillons biologiques par un test d'inhibition de chimiluminescence. Protocole Nat. septembre 2010 ; 5 (10) : 1627-34.

24. Ministre stvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11e éd. Iss. 2. "Analyse de la méthodologie Obshchie".

Lekarstvennoe rastitel "noe syr"e". Moscou : Medltsina ; 1987. p. 147-8. Russe.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. Pharmacie. 2012 ; (2) : 14-6. Russe.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsiya. 2010 ; (5) : 16-8. Russe.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsiya. 2014 ; (1) : 8-10. Russe.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Actes de la 14e Conférence homéopathique internationale de Moscou « Razvitie gomeopaticheskogo methoda v sovremennoi meditsine » ; 24-25 janvier 2014 ; Moscou M. ; .p.7. Russe .

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologiqueheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr"e razlichnykh sposobov konservatsii. Actes du 20e Congrès national russe « Chelovek i lekarstvo » ; 2013 avril 1519 ; Moscou. Moscou : EkOOnis ; 2013. p. 184-90. Russe.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil"nosti k razlichnym vozdeistviyam. Bulletin de chimie de l'Université de Moscou. 2006 ; 47 (5) : 350-2. Russe.