Določanje skupne antioksidativne aktivnosti. Diplomsko delo: antioksidativne lastnosti dihidrokvercetina. Besedilo znanstvenega dela na temo "Kemiluminiscenčna metoda za določanje skupne antioksidativne sposobnosti v zdravilnih rastlinskih materialih"

19.09.2023

Izum se nanaša na živilsko industrijo in se lahko uporablja pri določanju skupne antioksidativne aktivnosti. Metoda se izvede na naslednji način: analit interagira z reagentom 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina. Askorbinska kislina (AA) reagira z istim reagentom, ki ga dodamo v razmerju 1:100. Nato inkubiramo vsaj 90 minut in fotometriramo pri 510 ± 20 nm. Po tem se ugotovi odvisnost velikosti analitičnega signala od količine snovi in izračuna vrednost celotnega AOA. Predstavljena metoda omogoča manj delovno intenzivno in bolj zanesljivo določanje skupne antioksidativne aktivnosti rastlinskih surovin in živil na njihovi osnovi. 2 plača f-ly, 1 ilustr., 5 tabel.

Izum se nanaša na analizno kemijo in se lahko uporablja pri določanju skupne antioksidativne aktivnosti (AOA) rastlinskih surovin in živilskih izdelkov na njegovi osnovi.

Znana je kulometrična metoda za določanje skupne AOA čaja, ki temelji na interakciji vodnih ekstraktov izdelka z električno generiranimi bromovimi spojinami (I.F.Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov. Kulometrična ocena antioksidativne sposobnosti čajnih ekstraktov z električno generiranega broma // Journal of Chemistry 2001. T.56. P.627-629). Izbira elektrogeneriranih bromovih spojin kot titranta je posledica njihove zmožnosti vstopanja v različne reakcije: radikalne, redoks, elektrofilne substitucije in adicije na več vezeh. To nam omogoča, da pokrijemo širok spekter biološko aktivnih čajnih spojin, ki imajo antioksidativne lastnosti. Slabosti te metode so možnost reakcije bromiranja s snovmi, ki niso antioksidanti, ter izražanje dobljene vrednosti celotnega AOA v enotah elektrike (kC/100 g), kar otežuje ovrednotenje dobljenih rezultatov.

Znana je voltametrična metoda za določanje celotne antioksidativne aktivnosti z relativno spremembo toka elektroredukcije kisika v potencialnem območju od 0,0 do -0,6 V (rel. sat. h.s.e.) na živosrebrovi filmski elektrodi (pat. 2224997, Rusija, IPC 7 G 01 N 33/01 Voltametrična metoda za določanje skupne aktivnosti antioksidantov / Korotkova E.I., Karbainov Yu.A. Pomanjkljivost te metode je, da pride do stranskih elektrokemijskih reakcij, zaradi česar se zmanjša učinkovitost določanja antioksidantov, kar povzroči zmanjšanje zanesljivosti rezultatov.

Znana je metoda za spremljanje celotne AOA preventivnih in terapevtskih antioksidantov s peroksidacijo lipidov v malonaldehid s spektrofotometrično ali kemiluminiscentno detekcijo (Pat. 2182706, Rusija, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. Metoda za spremljanje antioksidativna aktivnost preventivnih in terapevtskih antioksidantov / Pavljučenko I.A., Fedosov S.R. - št. V tem primeru je antioksidativna aktivnost obratno sorazmerna s stopnjo produktov lipidne peroksidacije. Pomanjkljivost te metode je omejen obseg analiziranih predmetov, saj se v teh pogojih določi samo ena skupina antioksidantov - lipidi.

Znana je metoda za določanje skupne AOA rastlinskega izvlečka, ki obsega inkubacijo izvlečka z linetolom in železovim (II) sulfatom, sprožitev oksidacijske reakcije z UV obsevanjem in kasnejšo interakcijo s tiobarbiturno kislino v prisotnosti Triton X- 100 (prijava 97111917/13, Rusija, IPC 6 G 01 N 33/00. Metoda za določanje splošne antioksidativne aktivnosti / Rogozhin V.V. - prijava 08.07.1997; Pri izvajanju spektrofotometrije se uporablja mešanica etanola in kloroforma v razmerju 7:3. Vrednost AOA biološkega materiala je določena z razmerjem akumulacije produkta reakcije - malondialdehida v vzorcu, ki vsebuje ekstrakt, proti vzorcu s prooksidantom. Pomanjkljivost te metode je možnost pojava stranskih reakcij med UV obsevanjem, kar zmanjšuje zanesljivost dobljenih rezultatov analize.

Naštete metode za določanje skupnega AOA imajo vrsto slabosti: visoka delovna intenzivnost, nizka zanesljivost, izmerjena vrednost skupnega AOA ni povezana in ni primerljiva z nobeno splošno sprejeto snovjo.

Najbližji analog predloženemu izumu je metoda za določanje skupne AOA zdravilnih rastlin z merjenjem kemiluminiscence, ki se pojavi med reakcijo z luminolom v prisotnosti oksidanta vodikovega peroksida (M.H. Navas, A.M. Khiminets, A.G. Azuero Determination of the luminol). redukcijska sposobnost kanarskega semena s kemiluminiscenco // Journal of analytical chemistry 2004. T. 84-86). Za količinsko opredelitev celotnega AOA smo primerjali redukcijsko sposobnost ekstrakta zdravilnih surovin in aktivnost močnega antioksidanta - askorbinske kisline v količini 25-110 μg. V primerjavi z naštetimi metodami uporablja prototip kot oksidant vodikov peroksid, ki medsebojno deluje s širokim naborom antioksidantov, izmerjeno vrednost celotnega AOA objekta pa določimo in izrazimo glede na askorbinsko kislino, ki je na splošno sprejet antioksidant, ki omogoča pridobitev zanesljivih rezultatov ob ohranjanju drugih pomanjkljivosti. Pomanjkljivosti vključujejo tudi zapletenost opreme, ki se uporablja pri metodi.

Tehnični cilj predloženega izuma je razviti manj delovno intenzivno in zanesljivo metodo za določanje skupne antioksidativne aktivnosti rastlinskih surovin in živilskih izdelkov na njegovi osnovi.

Za rešitev tehničnega problema je predlagana interakcija analita z reagentom 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina in askorbinske kisline (AA) z istim reagentom, ki se doda v razmerju 1:100. , inkubiramo vsaj 90 minut, fotometriramo pri 510±20 nm, sledi ugotavljanje odvisnosti vrednosti analitskega signala od količine snovi in izračun vrednosti celotnega AOA. Zlasti se lahko izračun izvede z uporabo formule (I), ki izhaja iz enačbe kvantitativne korespondence med proučevanim predmetom in askorbinsko kislino:

kjer sta a, b koeficienta v regresijski enačbi za odvisnost analitičnega signala od količine AC;

a", b" - koeficienti v regresijski enačbi za odvisnost analitičnega signala od količine preučevanega predmeta;

x sonce - masa preučevanega reducenta (vzorca), mg.

Uporaba predlaganega reagenta pod določenimi pogoji je omogočila razširitev linearnega območja in znižanje spodnje meje določenih količin askorbinske kisline. Predlagani nabor bistvenih značilnosti omogoča določanje skupne AOA širokega nabora rastlinskih surovin in živil na njihovi osnovi.

Kvantitativne korespondenčne enačbe povezujejo odvisnost analiznega signala od količine askorbinske kisline in odvisnost analiznega signala od količine testnega predmeta ob enaki antioksidativni aktivnosti.

Po obdelavi rezultatov fotometričnih meritev velikosti analitičnega signala z uporabo metode najmanjših kvadratov (K. Derffel Statistics in analytical chemistry. - M.: "Mir", 1994. P.164-169; A.K. Charykov Matematična obdelava rezultati kemijske analize - L.: Chemistry, 1984. str. 137-144) so bile te odvisnosti opisane z linearno regresijsko funkcijo: y=ax+b, kjer je a regresijski koeficient, b je prosti člen. Koeficient a v regresijski enačbi je enak tangensu naklonskega kota premice na os x; koeficient b - razdalja vzdolž osi y od izhodišča (0,0) do prve točke (x 1, y 1).

Koeficienta a in b izračunamo po formulah:

Regresijska enačba za odvisnost AS od količine askorbinske kisline v določenem času ima obliko:

y AK = a x AK (mg) + b,

regresijska enačba za odvisnost AC od količine proučevanega predmeta (redukcijsko sredstvo):

y VOST =a" x VOST (mg)+b",

kjer je pri AK, pri VOST optična gostota fotometrirane raztopine;

x AA (mg), x VOST (mg) - koncentracija askorbinske kisline (redukcijsko sredstvo) v raztopini;

nato z izenačitvijo vrednosti funkcij dobimo formulo (I) za izračun antioksidativne aktivnosti preučevanega predmeta v količinskih enotah (mg) askorbinske kisline.

Risba prikazuje odvisnost analiznega signala od količine reducenta.

Optično gostoto analiziranih raztopin smo izmerili s fotoelektrokolorimetrom KFK-2MP.

Znano je (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Wünsch Kompleksne spojine v analitični kemiji - M.: Mir, 1975. - 531 str.), da o-fenantrolin tvori vodotopen kelat z železom ( II) rdeče-oranžna barva, za katero je značilen absorpcijski maksimum pri λ=512 nm. Zato se v predlagani metodi fotometrija izvaja pri λ=510±20 nm.

Optimizacija sestave reagenta in njegove količine, vnesene v reakcijo, je bila izvedena na podlagi rezultatov večfaktorske eksperimentalne zasnove z uporabo metode "latinskega kvadrata", ki je vključevala spreminjanje vseh proučevanih faktorjev v vsakem poskusu in vsaki ravni. vsakega dejavnika se pojavi samo enkrat z različnimi stopnjami drugih dejavnikov. To vam omogoča, da izolirate in ocenite učinek, ki ga povzroči vsak proučevani dejavnik posebej.

Dejavniki so bili: količina Fe(III), o-fenantrolina in volumen reagenta, ki smo ga vnesli v reakcijo. Kombinacija dejavnikov naj bi zagotavljala širok razpon linearnosti analitičnega signala (AS) z zadostno občutljivostjo na eni strani in stabilnostjo reagenta v času na drugi strani. To je omogočilo identifikacijo naslednjih ravni za vsak dejavnik:

količina Fe(III): 0,003 M (A 1); 0,006 M (A 2); 0,009 M (A 3);

količina o-fenantrolina: 0,01 M (B 1); 0,02 M (B 2); 0,03 M (B 3);

prostornina reagenta: 0,5 ml (C 1); 1,0 ml (C 2); 2,0 ml (C 3) (tabela 1).

Za izbiro optimalne kombinacije ravni faktorjev smo pridobili umeritvene odvisnosti AC od količine askorbinske kisline v območju od 10 do 150 μg (kar je potrebno za potrditev linearnosti funkcije), izračunali regresijsko enačbo dobljene odvisnosti , nato pa izračunali vrednost AC pri dani količini (120 μg) askorbinske kisline. Tako je bila za vsako sestavo reagenta (faktorja A, B) izbrana prostornina (faktor C), pri kateri je vrednost AC največja. To nam je omogočilo zmanjšanje števila obravnavanih kombinacij na devet (tabela 2).

S primerjavo celotnega AC za vsako raven smo ugotovili količine z največjo vrednostjo: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ΣC 2 (1,361). To nam je omogočilo, da sklepamo, da je optimalna sestava reagenta: 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina z volumnom, uvedenim v reakcijo 1,0 ml na 100 ml raztopine.

Pri optimalni koncentraciji reagenta smo proučevali spremembo odvisnosti AS od koncentracije askorbinske kisline in nekaterih reduktivnih sredstev, ki so pogosta v naravnih objektih (tanin, rutin, kvercetin) pri različnih inkubacijskih časih reakcijske mešanice (30, 60 , 90, 120 min). Ugotovljeno je bilo, da je za vse proučevane redukcijske snovi odvisnost AC od njihove vsebnosti linearna v območju 10-150 μg (glej risbo), vrednost AC pa je odvisna od časa inkubacije (tabela 3).

Iz risbe je razvidno, da je sprememba AC pod vplivom rutina nepomembna, tanin se približuje, kvercetin pa presega podobno odvisnost za askorbinsko kislino. Pri upoštevanju spremembe AS v odvisnosti od inkubacijskega časa za vsa proučevana redukcijska sredstva (tabela 3) je bilo ugotovljeno, da se stabilizacija analitičnega signala skozi čas opazi od 90 minut.

Tabela 3 Sprememba AC reducentov skozi čas
Preskusna snov	m snov, mg/cm3	Analitični signal
Preskusna snov	m snov, mg/cm3	Inkubacijski čas reakcijske mešanice, min
30	60	90	120
Askorbinska kislina	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
tanin	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutin	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Kvercetin	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Za dokaz sumativne narave določene vrednosti AOA smo proučevali vpliv Fe (III) reagenta - o-fenantrolina na modelne raztopine, ki so vsebovale reducente: tanin, rutin, kvercetin in askorbinsko kislino v različnih razmerjih. V tabeli 4 so prikazani rezultati analize modelnih mešanic.

Tabela 4 Rezultati analize modelnih mešanic (P=0,95; n=3)
Število komponent v mešanici	Skupni AOA, izračunan, µgAC	Skupni AOA, ugotovljen, µgAC
predstavljen	Skupni AOA, izračunan, µgAC	Skupni AOA, ugotovljen, µgAC	glede na AK
AK	tanin	Rutin	Kvercetin	AK	tanin	Rutin	Kvercetin
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Izračun teoretične vrednosti celotnega AOA je bil izveden z uporabo kvantitativnih korespondenčnih enačb, ki označujejo antioksidativno zmogljivost proučevanega reducenta glede na askorbinsko kislino, v pogojih enake antioksidativne aktivnosti: .

Vrednost eksperimentalne (ugotovljene) AOA smo izračunali s pomočjo povprečne regresijske enačbe za odvisnost AC od količine askorbinske kisline. Iz rezultatov, predstavljenih v tabeli 4, je razvidno, da se eksperimentalno dobljene vrednosti AOA zadovoljivo ujemajo s teoretično izračunanimi.

Tako je ugotovljena vrednost AOA sumarni kazalnik, določitev njene vrednosti s pomočjo kvantitativnih korespondenčnih enačb pa je pravilna.

Predlagana metoda je bila testirana na realnih vzorcih. Za določitev celotnega AOA pravega vzorca ali njegovega ekstrakta so bile pridobljene umeritvene odvisnosti AC od količine analita in askorbinske kisline z inkubacijskim časom reakcijske mešanice najmanj 90 minut. Izračun celotne AOA je bil izveden po formuli (I) in izražen v mg askorbinske kisline na gram testnega objekta (mgAA/g).

Za potrditev pravilnosti predlagane metode so bili ti vzorci testirani z znanimi metodami, pri čemer so ocenili vsebnost askorbinske kisline (GOST 24556-89 Predelani proizvodi sadja in zelenjave. Metode za določanje vitamina C) in prevladujočih reducentov: tanina v čaju. (GOST 19885-74 Čaj. Metode za določanje vsebnosti tanina in kofeina), v šipku - količino organskih kislin (GOST 1994-93 Šipek. Tehnični pogoji) (tabela 5).

diplomsko delo

1.4 Metode raziskovanja antioksidantov

antioksidativno delovanje razvrščamo: glede na metode beleženja manifestirane AOA (volumetrične, fotometrične, kemiluminiscentne, fluorescentne, elektrokemijske); po vrsti vira oksidacije; glede na vrsto spojine, ki se oksidira; z metodo merjenja oksidirane spojine.

Vendar pa so najbolj znane metode za določanje antioksidativne aktivnosti:

1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): metoda temelji na naslednji reakciji:

Metmioglobin + H 2 O 2 > Ferilglobin + ABTS > ABTS * + AO.

Metoda Trolox equivalents (TEAC) temelji na sposobnosti antioksidantov, da reducirajo 2,2-azinobis radikalne katione (ABTS) in s tem zavirajo absorpcijo v dolgovalovnem območju spektra (600 nm). Bistvena pomanjkljivost metode je dvostopenjska reakcija za tvorbo radikala. To podaljša čas analize in lahko poveča razpršitev rezultatov, kljub dejstvu, da se za analizo uporablja standardiziran nabor reagentov.

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): metoda temelji na naslednji reakciji:

Fe(III)-tripiriditriazin+AO>Fe(II)-tripiridiltriazin.

Zmogljivost zmanjševanja železa/antioksidant (FRAP). Tu uporabljena reakcija je redukcija Fe(III)-tripiridiltriazina v Fe(II)-tripiridiltriazin. Vendar pa ta metoda ne more določiti določanja nekaterih antioksidantov, kot je glutation. Ta metoda omogoča neposredno določanje nizkomolekularnih antioksidantov. Pri nizkem pH redukcijo kompleksa Fe(III)-tripiridiltriazina v kompleks Fe(II) spremlja pojav intenzivne modre barve. Meritve temeljijo na sposobnosti antioksidantov, da zavirajo oksidativni učinek reakcijskih vrst, ki nastanejo v reakcijski mešanici. Ta metoda je preprosta, hitra in poceni za izvedbo.

3 ORAC (zmožnost absorpcije kisikovih radikalov): metoda temelji na naslednji reakciji:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Določanje absorbančne kapacitete kisikovih radikalov (ORAC). Pri tej metodi se zabeleži fluorescenca substrata (fikoeritrina ali fluoresceina), ki nastane kot posledica njegove interakcije z ROS. Če testni vzorec vsebuje antioksidante, opazimo zmanjšanje fluorescence v primerjavi s kontrolnim vzorcem. To metodo je prvotno razvil dr. Guohua Kao na Nacionalnem inštitutu za staranje leta 1992. Leta 1996 se je dr. Kao združil z dr. Ronaldom Pryerjem v skupni skupini v Centru za raziskovanje staranja USDA, kjer je bila polavtomatska metoda ustvarili.

4 TRAP (parameter skupnega antioksidanta lovljenja radikalov): metoda temelji na naslednji reakciji:

AAPH+AO>AAPH* + PL (FE).

Ta metoda uporablja sposobnost antioksidantov za interakcijo s peroksilnim radikalom 2,2-azobis(2-amidinopropan) dihidrokloridom (AAPH). Modifikacije TRAP so sestavljene iz metod za snemanje analitičnega signala. Najpogosteje na končni stopnji analize peroksi radikal AAPH interagira z luminiscentnim (luminol), fluorescentnim (diklorofluorescein diacetat, DCFH-DA) ali drugim optično aktivnim substratom.

Vodotopni derivat vitamina E Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksi kislina) se uporablja kot standard za metode TEAC, ORAC in TRAP.

V zadnjem času se je povečalo zanimanje za uporabo elektrokemičnih metod za oceno antioksidativne aktivnosti. Te metode imajo visoko občutljivost in hitro analizo.

Ocena antioksidativne aktivnosti nekaterih živil se izvaja s potenciometrično metodo, ki temelji na uporabi lastnosti antioksidantov, da sodelujejo v redoks reakcijah zaradi enolnih (-OH) in sulfhidrilnih (-SH) skupin.

Določanje antioksidativnih lastnosti raztopin temelji na kemijski interakciji antioksidantov z mediatorskim sistemom, kar vodi do spremembe njegovega redoks potenciala. Elektrokemična celica je vsebnik, ki vsebuje raztopino K-Na-fosfatnega pufra, mediatorski sistem Fe(III)/Fe(II) in kompleksno elektrodo pred merjenjem redoks potenciala. Antioksidativno delovanje ocenjujemo v g-eq/l.

Amperometrična metoda za določanje antioksidativne aktivnosti temelji na merjenju električnega toka, ki nastane pri oksidaciji preizkušane snovi na površini delovne elektrode, ki je pod določenim potencialom. Občutljivost amperometrične metode je določena z naravo delovne elektrode in potencialom, ki se nanjo nanaša. Meja zaznavnosti amperometričnega detektorja polifenolov in flavonoidov je pri tako nizkih koncentracijah manjša verjetnost medsebojnega vpliva različnih antioksidantov, zlasti manifestacija pojava sinergije; . Slabosti metode so njena specifičnost: v teh pogojih ni mogoče analizirati antioksidantov, ki so sami oksidirani ali reducirani v območju elektroredukcijskih potencialov kisika. Prednosti metode so njena hitrost, prostata in občutljivost.

Metoda galvanostatske kulometrije z uporabo električno generiranih oksidantov - metoda je uporabna za analizo v maščobi topnih antioksidantov.

Za določanje askorbinske kisline so bile razvite različne metode:

amperometrična metoda z uporabo aluminijaste elektrode, modificirane s filmom nikljevega (II) heksacianoferata s preprosto potopitvijo v raztopino;

metoda za trdnofazno spektrofotometrično in vizualno testno določanje askorbinske kisline z uporabo kserogela silicijeve kisline, modificiranega z Wawelejevim reagentom in bakra (II) kot indikatorskega praška;

kemiluminiscenčno določanje askorbinske kisline lahko izvedemo s pretočno injekcijsko metodo z uporabo kemiluminiscenčne reakcije rodamina B s cerijem (IV) v mediju žveplove kisline.

določanje askorbinske kisline v območju 10 -8 -10 -3 g/cm 3 z anodno voltametrijo v vodnih in vodno-organskih medijih.

Najpogostejša je metoda FRAP, saj je hitra in zelo občutljiva. V zadnjih nekaj desetletjih je bilo razvitih veliko število vrst metod za določanje antioksidativne aktivnosti z metodo FRAP (tabela 1).

Tabela 1 Razvoj metode FRAP in njena uporaba za določanje antioksidativne aktivnosti različnih predmetov

	Objekti analize	Opombe
	Krvna plazma	t=4min. Proučevali smo reakcijsko stehiometrijo in aditivnost.
	Čaj, vino	Določanje AOA zaradi polifenolov
		Primerjali smo vrednosti AOA različnih sort čaja
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Modelne rešitve	t=30min. Ugotovljen je bil vpliv nevodnega topila
	Rastline
	Kri, tkivo	metoda PIA. Vpliv tujkov je testiran.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.	Modelne rešitve	Občutljivost določanja različnih AO smo preučevali v odvisnosti od njihove strukture in redoks potenciala.
Katalinić, Miloš,	Različna vina
Temerdashev, Tsyupko in drugi.	Modelne mešanice
Loginova, Konovalova	Zdravila Zdravila	Preskusna metoda
Temerdashev, Tsyupko in drugi.	Suha rdeča vina	Korelacija AOA z drugimi kazalci kakovosti vina
Nadaljevanje tabele 1
	Modelne mešanice	Proučevali smo občutljivost določanja različnih AO
Veršinin, Vlasova, Tsjupko	Modelne mešanice	Ugotovljeno je bilo, da signal ni aditiven, če je primanjkovalo oksidanta
Anisimovič, Deineka in drugi.	Modelne rešitve	Predlagani so bili kinetični parametri za ocenjevanje AOA.

Opombe: konvencionalno označeno: FIA-pretočna injekcijska analiza, TPTZ-tripiridiltriazin, DIP-2,2,-dipiridil, PHEN-o-fenantrolin, DPA-piridin dikarboksilna kislina, FZ-ferozin, AA-askorbinska kislina, CT-katehol, t - čas osvetlitve, min.

Interakcija med proteini in polielektroliti v vodnih raztopinah

Za karakterizacijo beljakovinsko-polielektrolitnih kompleksov se uporabljajo različne analizne metode. Instrumentalne metode zagotavljajo informacije o strukturnih in optičnih lastnostih ter določajo dinamiko in naravo vezave PEC...

Vpliv spojin d-kovine na hitrost disociacije molekule vode v bipolarni membrani

V procesu sinteze novih BPM je treba veliko pozornosti nameniti preučevanju lastnosti dobljenih vzorcev za kasnejšo izbiro pogojev sinteze, ki zagotavljajo izboljšanje elektrokemijskih lastnosti sintetiziranih membran ...

Dizajnerske droge in sintetični kanabinoidi

Detekcija sintetičnih kanabinoidov v rastlinskih mešanicah se lahko izvaja z različnimi fizikalno-kemijskimi metodami, kot so kromatografija-masna spektrometrija, plinska kromatografija, tankoplastna kromatografija in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti...

Razvoj metode za določanje flavonoidov v zdravilnih rastlinskih materialih

Sinteza in farmakološke lastnosti kinolinonov-2

Predmet študije: kinolinon-2. Metoda raziskovanja: Z uporabo računalniškega programa "Marvin JS" je bila ustvarjena struktura snovi. Nato so jo poslali na spletno stran "http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php" za nadaljnje raziskave ...

Termična spektralna metoda za preučevanje produktov izhlapevanja epoksi polimerov

Tehnologija za proizvodnjo visoko prečiščenega hitozana iz oklepov rakov

Določanje molekulske mase hitozana Molekulsko maso hitozana smo določili viskozimetrično po standardni metodi. Raztopini koncentracije 0,05 in 0,5 g/dl smo pripravili z raztapljanjem vzorca polimernega prahu v acetatnem pufru (0...

Fizikalno-geografske značilnosti ozemlja naravnega parka

], vendar definicija antioksidantov kot kemičnih spojin ne daje popolne slike zaščitnih lastnosti preučevanega predmeta: določa jih ne le količina določenega antioksidanta, temveč tudi aktivnost vsakega od njih. Antioksidativna aktivnost ali antioksidativna aktivnost, AOA, je konstanta hitrosti reakcije antioksidanta s prostim radikalom (kInH). S kemiluminescenčno (CL) metodo je mogoče določiti skupno količino radikalov, ki vežejo antioksidante v vzorcu (total antioxidant capacity, TAU), pri uporabi metode matematičnega modeliranja kinetike CL pa tudi hitrost nastajanja in reakcije radikalov z antioksidanti, to je AOA [, ,].

Najpogostejša modifikacija kemiluminiscenčne metode za določanje skupne antioksidativne kapacitete temelji na uporabi luminola kot aktivatorja kemiluminiscence [, , ,]. Vzorec se postavi v kemiluminometrsko kiveto z dodatkom luminola, vodikovega peroksida in spojine, ki je sposobna tvoriti radikale kot rezultat spontane razgradnje (termoliza), na primer 2,2'-azobis-(2-amidinopropan) dihidroklorida (ABAP). ): ABAP → 2R. V prisotnosti molekularnega kisika alkilni radikal R tvori peroksilni radikal ROO: R + O 2 → ROO. Nato peroksilni radikal oksidira kemiluminiscenčno sondo luminol (LH 2) in nastane luminolni radikal (LH): ROO + LH 2 → ROOH + LH. Iz LH s tvorbo vmesnih snovi (luminol hidroperoksida in luminol endoperoksida) nastane v elektronsko vzbujenem stanju molekula končnega produkta oksidacije luminola aminoftalne kisline, ki oddaja foton, posledično pa opazimo kemiluminiscenco. . Intenzivnost CL je sorazmerna s hitrostjo produkcije fotonov, ta pa je sorazmerna s stacionarno koncentracijo LH v sistemu. Z interakcijo z radikali antioksidanti prekinejo opisano verigo transformacij in preprečijo nastanek fotona.

Spojine, dovzetne za termolizo, niso edini možni vir radikalov pri analizi antioksidativne sposobnosti vzorca s kemiluminiscenčno metodo. Alternative so sistemi hrenova peroksidaza–vodikov peroksid [, ], hemin–vodikov peroksid, citokrom z–kardiolipin–vodikov peroksid itd. Reakcijska shema za oksidacijo luminola s peroksidazami je obravnavana v delu Cormier et al. .

Kinetične krivulje CL za te sisteme odražajo dve stopnji reakcije: stopnjo naraščajoče intenzivnosti CL in stopnjo platoja ali postopnega upadanja luminiscence, ko je intenziteta CL konstantna ali počasi upada. Delo opisuje dva pristopa k merjenju celotne antioksidativne kapacitete, ki upoštevata to značilnost krivulj. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) temelji na merjenju latentne dobe CL. τ in jih je mogoče uporabiti za določanje antioksidantov, kot sta Trolox ali askorbinska kislina: zanje je značilna visoka konstanta hitrosti reakcije z radikali in jih zato lahko imenujemo močni antioksidanti. V latentnem obdobju pride do njihove popolne oksidacije. Metoda TAR (Total Antioxidant Reactivity) meri stopnjo dušenja kemiluminiscence q na platoju ali maksimumu kemiluminiscenčne krivulje: formula, kjer je I intenziteta kemiluminiscence brez antioksidanta, I 1 pa intenziteta CL v prisotnosti antioksidanta. Ta metoda se uporablja, če sistem vsebuje pretežno šibke antioksidante z nizkimi konstantami hitrosti interakcije z radikali - veliko nižjimi v primerjavi s konstanto luminola.

Učinek antioksidantov ni označen le z indikatorji τ in q. Kot je razvidno iz del [,], je učinek antioksidantov, kot je sečna kislina v sistemu hemin–H 2 O 2 –luminol ali tokoferol, rutin in kvercetin v sistemu citokroma. z–kardiolipin–H 2 O 2 –luminol, za katerega je značilna sprememba največje stopnje povečanja CL ( vmax). Kot kažejo rezultati matematičnega modeliranja kinetike, so vrednosti konstant hitrosti interakcije teh antioksidantov z radikali blizu vrednosti konstante luminola, zato lahko takšne antioksidante imenujemo antioksidanti srednje moči.

Če bi proučevani material, zlasti rastlinske surovine, vseboval samo eno vrsto antioksidantov, bi lahko njihovo vsebnost označili z enim od treh zgoraj navedenih indikatorjev ( τ , q oz vmax). Toda rastlinski materiali vsebujejo mešanico antioksidantov različnih jakosti. Za rešitev tega problema so nekateri avtorji [ , , , ] uporabili spremembo svetlobne vsote kemiluminiscence v določenem času ∆S, izračunano po formuli , kjer je ∆ S 0 in ∆ S S- CL svetlobne vsote za določen čas t v kontrolnem oziroma testnem vzorcu. Čas mora zadostovati za oksidacijo vseh antioksidantov v sistemu, to je, da CL krivulja testnega vzorca doseže raven CL krivulje kontrolnega vzorca. Slednje predvideva, da morajo raziskovalci ne samo beležiti svetlobno vsoto sija, ampak tudi dovolj dolgo časa snemati kinetično krivuljo CL, kar pa ni vedno storjeno.

Ker so vsi merjeni parametri odvisni od naprave in merilnih pogojev, se antioksidativni učinek snovi v proučevanem sistemu običajno primerja z učinkom antioksidanta, ki je vzet kot standard, na primer Trolox [,].

Sistem hrenove peroksidaze–vodikovega peroksida so mnogi avtorji uporabili za analizo skupne antioksidativne sposobnosti rastlinskih materialov. V delih [,] je bila za oceno količine antioksidantov v vzorcih uporabljena latentna doba CL (metoda TRAP), v delih [, ,] pa površina pod krivuljo razvoja CL. Vendar navedena dela ne dajejo jasne utemeljitve izbire enega ali drugega parametra za ocenjevanje OAU.

Namen raziskave je bil ugotoviti, kako razmerje različnih vrst antioksidantov vpliva na TOA, in modificirati kemiluminiscenčno metodo na način, da bi lahko natančneje določali TOA v rastlinskih materialih. Za to smo si zadali več nalog. Najprej primerjajte kinetiko CL proučevanih predmetov s kinetiko standardnih antioksidantov treh vrst (močnih, srednjih in šibkih), da bi razumeli, katera vrsta antioksidantov ima glavni prispevek k OAU preučevanih predmetov. Drugič, izračunajte OAE preučevanih predmetov z merjenjem zmanjšanja svetlobne vsote CL pod vplivom teh predmetov v primerjavi z učinkom antioksidanta, ki daje največji prispevek k OAE.

MATERIALI IN METODE

Predmet študije so bili industrijski vzorci gloga, jerebike in šipka, ki jih proizvaja JSC Krasnogorskleksredstva (Rusija), pa tudi plodovi malin, ki so jih avtorji zbrali v moskovski regiji v naravnih pogojih rasti in posušili pri temperaturi 60–80 ° C, dokler ne prenehajo izpuščati soka in deformacije ob pritisku.

Reagenti za analizo antioksidativne kapacitete s kemiluminiscenčno metodo so bili: KH 2 PO 4, 20 mM puferska raztopina (pH 7,4); peroksidaza iz korenin hrena (aktivnost 112 enot/mg, M = 44.173,9), 1 mM vodna raztopina; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kisline, M = 177,11), 1 mM vodna raztopina; vodikov peroksid (H 2 O 2, M = 34,01), 1 mM vodna raztopina; raztopine antioksidantov (askorbinska kislina, kvercetin, tokoferol). Vse reagente proizvaja Sigma Aldrich (ZDA).

Odvarki plodov gloga, jerebike in šipka ter poparek plodov maline so bili pripravljeni po metodah Državne farmakopeje ZSSR, ki so navedene v splošnem farmakopejskem članku "Infuzije in decokcije".

Določitev celotne antioksidativne kapacitete je bila izvedena s snemanjem kemiluminiscence na kemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) s programsko opremo PowerGraph 3.3. Za določanje OAE v rastlinskem materialu uporabimo 40 μl luminola v koncentraciji 1 mM, 40 μl hrenove peroksidaze v koncentraciji 0,1 μM, od 10 do 50 μl prevretka ali poparka (odvisno od koncentracije) in fosfatni pufer v zahtevano količino vstavite v kiveto naprave, da skupni volumen vzorca doseže 1 ml. Kiveto smo namestili v napravo in CL posneli ob opazovanju signala ozadja. Po 48 s snemanja signala ozadja smo v kiveto dodali 100 μl H2O2 v koncentraciji 1 mM in snemanje CL nadaljevali 10 minut. Pripravljeni so bili štirje vzorci z različnimi koncentracijami vsakega rastlinskega predmeta. CL je bil zabeležen tudi za raztopine askorbinske kisline, kvercetina in tokoferola pri petih različnih koncentracijah za vsak antioksidant. Nato je bila OAU vzorcev decokcij in poparkov preračunana na kvercetin.

Koncentracije luminola, hrenove peroksidaze in vodikovega peroksida smo izbrali tako, da smo v sprejemljivem času (največ 10 min) določili antioksidativno sposobnost vodnih izvlečkov zdravilnih rastlinskih surovin. V tem času sta krivulji kemiluminiscence za antioksidanta askorbat in flavonoid kvercetin (glavna antioksidanta rastlinskih materialov) dosegli plato, kar kaže na popolno uničenje antioksidantov v sistemu. Razredčitve proučevanih vzorcev in koncentracije raztopin standardnih antioksidantov (navedene v legendah k slikam) so bile izbrane tako, da so bile vse kinetične krivulje CL izmerjene pri enaki občutljivosti naprave.

Antioksidativna zmogljivost je bila izračunana iz spremembe površine (∆ S) pod kinetično krivuljo kemiluminiscence (vsota svetlobe) pri dodajanju snovi, ki vsebuje antioksidant. V ta namen smo izračunali S 0 za sistem brez antioksidanta in od tega odštel površino S S, ki opisuje sistem, ki mu je bil dodan antioksidant. Vrednost ∆ S odvisno od občutljivosti kemiluminometra in merilnih pogojev. Razmerje ∆ S/C V(Kje C- koncentracija preučevanega biološkega materiala v kiveti, g / l, in V- prostornina kivete, l) izraža antioksidativno zmogljivost 1 g proučevanega materiala, to je rastlinskih surovin.

Na podoben način smo izračunali antioksidativno kapaciteto ∆ S A raztopino standardnega antioksidanta, na primer kvercetina, damo v isti volumen reakcijske zmesi. Razmerje ∆ S A / C A V(Kje C A- masna koncentracija antioksidanta v kiveti, g/l) izraža antioksidativno sposobnost 1 g antioksidanta.

Za vsakega od standardnih antioksidantov je bil zabeležen signal iz raztopin različnih koncentracij, da se zagotovi, da so izračuni v linearnem razmerju in da so dobljeni rezultati ponovljivi. Dejansko je bila pridobljena linearna odvisnost (∆ S A = k A C A) signal iz koncentracije, iz katere je bil izračunan stehiometrični koeficient k A. Po Fisherjevem kriteriju so dobljene vrednosti za standardne antioksidante k A statistično značilno z verjetnostjo 0,975. Nato smo zabeležili signal štirih koncentracij za vsakega od štirih rastlinskih vzorcev in za vse vzorce dobili linearno odvisnost signala od koncentracije (∆ S = k·C), iz katerega je bil izračunan stehiometrični koeficient k. Z verjetnostjo 0,975 (Fisherjev test) so vrednosti k, dobljene za vzorce rastlin, statistično značilne. Skupno antioksidativno zmogljivost rastlinskega materiala glede na maso standardnega antioksidanta (mg%) smo ugotovili s formulo.

Vrednosti so bile predstavljene kot aritmetična sredina ± standardna deviacija (M ± δ) pri p

REZULTATI RAZISKAVE

Študija kinetike kemiluminiscence v prisotnosti natrijevega askorbata (slika 1. Vpliv natrijevega askorbata na kinetiko kemiluminiscence" data-note="Koncentracije komponent sistema: luminol - 40 µM, hrenova peroksidaza - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 3 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM natrijev askorbat. Njegovo trajanje je sorazmerno s količino antioksidanta v sistemu. Hkrati se niti naklon CL niti intenzivnost CL na platoju ne spreminjata antioksidant, ki prestreže vse nastale radikale, vključno z radikali luminola, in CL se ne razvije, dokler ni ves askorbat.

Tudi drugi raziskovalci so pokazali, da se rezultati kemijske analize in vrednost TAU, določena s kemiluminiscenčno metodo, pogosto ne ujemajo. V delu je skupna antioksidativna kapaciteta, določena v sistemu peroksidaza–luminol–vodikov peroksid, korelirala z vsebnostjo triterpenskih spojin. Vendar pa v delu istih avtorjev, v katerem je bila predmet študije druga rastlina, niso opazili korelacije OAE z vsebnostjo katere koli skupine snovi, vključno s flavonoidi.

Takšna odstopanja so povezana z najmanj tremi dejavniki. Prvič, pomembna je aktivnost antioksidantov, to je hitrost njihove interakcije z radikali, ki je različna za različne antioksidante, vključene v rastlinski vzorec. Po Izmailovu se konstante hitrosti ustreznih reakcij za meksidol, tokoferol in kvercetin ujemajo kot 0,04: 2: 60. Drugič, vsaka molekula antioksidanta, ki vstopi v kemično reakcijo, lahko prestreže različno število radikalov. Glede na delo so kvercetin, sečna in askorbinska kislina prestregle 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 oziroma 0,5 ± 0,2 radikala na reagirano molekulo antioksidanta (uporabljen je bil sistem hemin–H 2 O 2 -luminol). Tretjič, na rezultate študije bi lahko vplivala prisotnost aktivnosti peroksidaze v samih rastlinskih vzorcih, kot v delu, pa tudi prisotnost kalcija v vzorcih, ki je, kot je prikazano v delu, sposobna povečati aktivnost hrenove peroksidaze pod določenimi pogoji. To običajno povzroči večjo intenzivnost CL na platoju kot na kontrolnih krivuljah, česar pa nismo opazili.

Prvi dejavnik močno omejuje uporabo takega parametra, kot je sprememba svetlobne vsote, saj mora biti čas merjenja kemiluminiscence daljši od časa porabe vseh antioksidantov v testnem vzorcu. O pojavu tega trenutka lahko presojamo le z merjenjem kinetike kemiluminiscence. Poleg tega je prispevek šibkih antioksidantov k TAU močno podcenjen, saj je čas njihove popolne oksidacije večkrat daljši od sprejemljivega trajanja meritev (10–20 min).

Še pomembnejši je stehiometrični koeficient antioksidanta. Število radikalov n ki ga prestreže je enako , kjer je ρ je stehiometrični koeficient in ∆ m- sprememba koncentracije antioksidanta med merjenjem, v našem primeru - začetne koncentracije testirane snovi v testnem vzorcu.

Razlika v svetlobni vsoti luminiscence v odsotnosti antioksidanta in v njegovi prisotnosti je sorazmerna n. Skupno število prestreženih radikalov je , kjer je ρ i je stehiometrični koeficient specifičnega antioksidanta in m i- njegovo koncentracijo med merjenjem. Skupno število prestreženih radikalov očitno ni enako skupni količini antioksidantov, saj koeficienti ρ i ne samo, da niso enaki enoti, ampak se tudi bistveno razlikujejo za različne antioksidante.

Magnituda n je sorazmeren z razliko v svetlobnih vsotah, izmerjenih v določenem času med vzorcem, ki vsebuje antioksidant, in kontrolnim vzorcem, ki ne vsebuje antioksidantov: S = k n, Kje k- koeficient, konstanten pri enakih merilnih pogojih.

Metoda, obravnavana v prispevku, nam omogoča določitev skupne antioksidativne kapacitete, s kemijsko analizo pa skupno vsebnost antioksidantov v izdelku. Zato se zdi, da je kemiluminiscenčna metoda bolj informativna kot kemijske analize.

Pogoji, ki smo jih izbrali za oceno skupne antioksidativne sposobnosti rastlinskih surovin s snemanjem kinetike kemiluminiscence v sistemu, ki ga sestavljajo hrenova peroksidaza, vodikov peroksid in luminol (koncentracije komponent - 4 nM, 100 µM oziroma 40 µM; 20 mM fosfat). pufer, pH 7,4), je zagotovil oksidacijo močnih antioksidantov (askorbinska kislina) in srednje močnih antioksidantov (kvercetin) v 10 minutah. To trajanje merjenja je priročno in zagotavlja zahtevano kakovost merjenja.

Analiza kinetike kemiluminiscence je pokazala, da so v preučevanih predmetih (decoctions rowan sadja, šipka, gloga in infuzije plodov maline) glavni antioksidanti srednje jakosti, vključno s flavonoidi, in šibke jakosti (tokoferol itd.). Na podlagi zmanjšanja kemiluminiscenčne svetlobne vsote je bila izračunana skupna antioksidativna kapaciteta proučevanih objektov. Primerjava dobljenih vrednosti TAU z rezultati kemijske analize je pokazala, da se lahko izdelki, ki vsebujejo enako količino antioksidantov z različnimi razmerji, razlikujejo po sposobnosti učinkovite zaščite telesa pred škodljivimi učinki prostih radikalov. Opisana tehnika je obetavna za preučevanje rastlinskih objektov, ki vsebujejo mešanico različnih antioksidantov. Hkrati ga odlikujeta enostavnost in nizka cena raziskave. Kombinacija merjenja kinetike kemiluminiscence z matematičnim modeliranjem reakcij bo omogočila ne le avtomatizacijo procesa določanja TAU, temveč tudi ugotavljanje prispevka posameznih skupin antioksidantov k indikatorju.

antioksidanti (AO)- snovi, ki preprečujejo oksidacijo.

V živem organizmu je vodilni dejavnik oksidacije nastajanje prostih radikalov, zato delovanje antioksidantov v bioloških sistemih obravnavamo predvsem z vidika preprečevanja oksidacije organskih snovi s prostimi radikali.

Trenutno obstaja veliko število različnih metod za določanje antioksidantov: fotometrične, kemične, elektrokemične itd. Vendar imajo mnoge od njih pomembne pomanjkljivosti, ki otežujejo razumevanje in nadaljnjo uporabo rezultatov, pridobljenih s temi metodami.
Najpogostejše pomanjkljivosti vključujejo naslednje:

Za merjenje antioksidativnega učinka se uporabljajo umetni ali za biološke sisteme neznačilni pogoji.

Namesto bioloških reakcij prostih radikalov se na primer uporabljajo čisto kemične redoks reakcije ali pa se meri sposobnost snovi, da oddaja/sprejema elektrone, ko je izpostavljena električnemu toku. Rezultati meritev, pridobljeni v takšnih pogojih, nam ne omogočajo reči, ali bo snov, ki jo preučujemo, v telesu pokazala enak "antioksidativni" učinek.

Določanje antioksidativnega učinka poteka z merjenjem količine akumuliranih produktov oksidacije (oksidacijski markerji). Na ta način je res možno določiti količino antioksidanta v testnem vzorcu, vendar se izpusti zelo pomembna informacija o delovanju antioksidanta.
Bistvena prednost tega pristopa je možnost uporabe različnih kemijskih sistemov za nastajanje prostih radikalov, kar omogoča nadaljnje ugotavljanje specifičnosti antioksidantov in lokalizacije njihovega delovanja.
Merjenje kvantitativnih in kvalitativnih lastnosti antioksidantov- kemiluminiscenčna metoda vam omogoča, da katero koli spojino, ki ima antioksidativni učinek, označite z dvema neodvisnima indikatorjema:
- Antioksidativna zmogljivost (AOE)- skupna količina prostih radikalov, ki lahko nevtralizira spojino v vzorcu določene prostornine.
- Antioksidativna aktivnost (AOA)- hitrost nevtralizacije prostih radikalov, tj. število nevtraliziranih radikalov na časovno enoto.

Namesto bioloških reakcij prostih radikalov se na primer uporabljajo čisto kemične redoks reakcije ali pa se meri sposobnost snovi, da oddaja/sprejema elektrone, ko je izpostavljena električnemu toku. daje pomembno razumevanje, da je treba učinek antioksidantov ocenjevati z dvema indikatorjema – kvantitativnim (AOE) in kvalitativnim (AOA).
Naslednja slika prikazuje to situacijo:

Vpliv različnih antioksidantov na kemiluminiscenco
(številke ob grafih označujejo koncentracijo antioksidantov):
na levi je "močan" antioksidant, na desni pa "šibek" antioksidant.

Antioksidanti se po svojem delovanju bistveno razlikujejo. Obstajajo "močni" antioksidanti, tj. Visoko aktivni antioksidanti, ki z visoko hitrostjo zavirajo proste radikale in popolnoma zavirajo kemiluminiscenco. Takšni antioksidanti imajo največji učinek že pri nizkih koncentracijah in se hitro porabijo.

Na drugi strani pa obstajajo »šibki« antioksidanti, tj. Nizko učinkoviti antioksidanti, ki zavirajo proste radikale pri nizki stopnji in le delno zavirajo kemiluminiscenco.

Takšni antioksidanti imajo pomemben učinek le v visokih koncentracijah, hkrati pa se počasi porabljajo in delujejo dolgotrajno.
Kemiluminiscenčno metodo lahko uporabimo za določanje antioksidativnih indikatorjev:
biološke tekočine (plazma, slina, urin);
farmakološka zdravila in prehranska dopolnila;
pijače in aditivi za živila;

kozmetični izdelki in izdelki za nego;

in itd.
Za izvedbo kemiluminiscenčne metode za določanje antioksidantov je priporočljivo uporabiti naslednjo opremo:

Kemiluminometer Lum-100 - zagotavlja termostatiranje in registracijo kemiluminiscence 1 vzorca.

Kemiluminometer Lum-1200 - omogoča nadzor temperature in hkratno registracijo kemiluminiscence za do 12 vzorcev. Ključne besede prosti radikal / skupna antioksidativna zmogljivost / kemiluminiscenca/ luminol / prosti radikal / antioksidant / antioksidativna aktivnost / skupna antioksidativna kapaciteta / kemiluminiscenca / luminol

opomba znanstveni članek o kemijskih znanostih, avtor znanstvenega dela - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu

Zdravilne rastlinske snovi so eden od virov antioksidantov za človeško telo. Med metodami za določanje vsebnosti antioksidantov v rastlinskih predmetih je metoda kemiluminiscenčne analize zelo razširjena. V tem delu je bil uporabljen za oceno skupna antioksidativna zmogljivost(OAE) decoctions rowan sadje, šipek in glog in infuzijo plodov maline. V poskusu smo zabeležili kinetiko kemiluminiscenca v sistemu, ki ga sestavljajo hrenova peroksidaza, vodikov peroksid in luminol. Koncentracije in volumen komponent sistema v vzorcu smo izbrali tako, da so močni antioksidanti (askorbinska kislina) in zmerni antioksidanti (kvercetin) v času meritve (10 min) popolnoma oksidirali. Predlagana in utemeljena je metoda za izračun OAE na podlagi sprememb svetlobne vsote kemiluminiscenca v prisotnosti rastlinskih vzorcev. Kinetična analiza kemiluminiscenca je pokazalo, da v proučevanih predmetih prevladujejo srednje močni antioksidanti, vključno s flavonoidi, in šibki antioksidanti (tokoferol itd.). Primerjava izračunanih vrednosti OAE za proučevane predmete in podatkov njihove kemijske analize je pokazala, da se izdelki, ki vsebujejo enako količino antioksidantov z različnimi razmerji glede na vrsto, lahko razlikujejo glede na sposobnost zaščite telesa pred škodljivimi učinki prostih radikalov. . Opisana tehnika je obetavna za preučevanje rastlinskih predmetov, ki vsebujejo mešanico antioksidantov različnih vrst.

Sorodne teme znanstvena dela v kemijskih znanostih, avtor znanstvenega dela - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu

2016 / Georgij Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Določanje antioksidantov z aktivirano kemiluminiscenco z uporabo 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Antioksidativni učinek dihidrokvercetina in rutina pri peroksidaznih reakcijah, ki jih katalizira citokrom c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Ocena oksidativne in antioksidativne sposobnosti bioloških substratov s kemiluminiscenco, inducirano s Fentonovo reakcijo
2016 / Piskarev Igor Mihajlovič, I.P. Ivanova
Določanje vsebnosti lipohidroperoksidov v serumskih lipoproteinih s sistemom mikroperoksidaza-luminol
2011 / Teselkin Jurij Olegovič, Babenkova Irina Vladimirovna
Antioksidativne raziskovalne metode
2004 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V.
Antioksidativna aktivnost rastlin, ki se uporabljajo v etnomedicini Tuve
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Študija antioksidativnih lastnosti Fosprenila v različnih bioloških testnih sistemih
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu Sanina, A. D. Agafonova
Vpliv različnih odmerkov polikloriranih bifenilov na stanje spontane in z imunoglobulini povzročene od luminola odvisne kemiluminiscence polne krvi
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kajumova A.F., Samohodova O.V.
Vrednotenje lipidno peroksidacijskega sistema antioksidativne zaščite pri otrocih z esencialno arterijsko hipertenzijo s spektrofotometrijo in kemiluminiscenčnimi metodami
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Kemiluminiscenčno določanje skupne antioksidativne kapacitete zdravilnih rastlin

Zdravilne rastline so eden od virov antioksidantov za človeško telo. Kemiluminescenčna analiza je ena izmed pogostih metod določanja vsebnosti antioksidantov v rastlinskih materialih. V našem delu smo s kemiluminescenčno analizo določili skupno antioksidativno kapaciteto (TAC) sadnih decokcij gorskega pepela, vrtnice in gloga ter poparka plodov maline. S poskusi je bila ugotovljena kinetika kemiluminiscence sistema, ki ga sestavljajo hrenova peroksidaza, vodikov peroksid in luminol. Koncentracije in volumni komponent sistema so bili izbrani tako, da so med merjenjem (10 minut) močni antioksidanti (askorbinska kislina) in antioksidanti srednje moči (kvercetin) popolnoma oksidirali. Predlagana in utemeljena je bila metoda za izračun TAC na podlagi sprememb kemiluminescenčne svetlobne vsote v prisotnosti rastlinskih vzorcev. Analiza kinetike kemiluminiscence je pokazala, da v proučevanih predmetih prevladujejo antioksidanti srednje moči, vključno s flavonoidi in šibkimi antioksidanti (tokoferol in drugi). Primerjava izračunanih vrednosti TAC za proučevane predmete in podatkov njihove kemijske analize je pokazala, da se izdelki, ki vsebujejo enako količino antioksidantov z različnimi razmerji antioksidantov po vrstah, lahko razlikujejo glede na sposobnost zaščite telesa pred škodljivimi učinki prostih radikalov. . Opisana tehnika je obetavna za preučevanje rastlinskih predmetov, ki vsebujejo mešanico različnih vrst antioksidantov.

Besedilo znanstvenega dela na temo “Kemiluminiscenčna metoda za določanje skupne antioksidativne kapacitete zdravilnih rastlinskih surovin”

kemiluminiscenčna metoda za določanje skupne antioksidativne kapacitete v zdravilnih rastlinskih materialih

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu A. Vladimirov1

1 Oddelek za medicinsko biofiziko, Fakulteta za temeljno medicino, Moskovska državna univerza M.V. Lomonosov, Moskva

2 Katedra za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo,

Prva Moskovska državna medicinska univerza po imenu I. M. Sechenov, Moskva

Zdravilne rastlinske snovi so eden od virov antioksidantov za človeško telo. Med metodami za določanje vsebnosti antioksidantov v rastlinskih predmetih je metoda kemiluminiscenčne analize zelo razširjena. V tem delu je bila uporabljena za oceno skupne antioksidativne zmogljivosti (TAC) decoctions plodov rowan, šipek in glog ter infuzijo plodov maline. V poskusu smo zabeležili kinetiko kemiluminiscence v sistemu, sestavljenem iz hrenove peroksidaze, vodikovega peroksida in luminola. Koncentracije in volumen komponent sistema v vzorcu smo izbrali tako, da so močni antioksidanti (askorbinska kislina) in zmerni antioksidanti (kvercetin) v času meritve (10 min) popolnoma oksidirali. Predlagana in utemeljena je bila metoda za izračun OAE na podlagi sprememb svetlobne vsote kemiluminiscence v prisotnosti rastlinskih vzorcev. Analiza kinetike kemiluminiscence je pokazala, da v proučevanih predmetih prevladujejo srednje močni antioksidanti, vključno s flavonoidi, in šibki antioksidanti (tokoferol itd.). Primerjava izračunanih vrednosti OAE za proučevane predmete in podatkov njihove kemijske analize je pokazala, da se izdelki, ki vsebujejo enako količino antioksidantov z različnimi razmerji glede na vrsto, lahko razlikujejo glede na sposobnost zaščite telesa pred škodljivimi učinki prostih radikalov. . Opisana tehnika je obetavna za preučevanje rastlinskih predmetov, ki vsebujejo mešanico antioksidantov različnih vrst.

Ključne besede: prosti radikal, antioksidant, antioksidativno delovanje, skupna antioksidativna kapaciteta, kemiluminiscenca, luminol

Financiranje: delo je podprla Ruska znanstvena fundacija, štipendija št. 14-15-00375.

Ex3 Za korespondenco: Georgij Konstantinovič Vladimirov

119192, Moskva, Lomonosovsky pr-t, 31, stavba 5; [e-pošta zaščitena]

Članek prejet: 10.03.2016 Članek sprejet v objavo: 18.03.2016

kemiluminiscenčno določanje skupne antioksidativne kapacitete zdravilnih rastlin

1 Oddelek za medicinsko biofiziko, Fakulteta za temeljno medicino, Moskovska državna univerza Lomonosov, Moskva, Rusija

2 Katedra za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo,

Prva moskovska državna medicinska univerza Sechenov, Moskva, Rusija

Ključne besede: prosti radikal, antioksidant, antioksidativno delovanje, skupna antioksidativna kapaciteta, kemiluminiscenca, luminol

Financiranje: to delo je podprla Ruska znanstvena fundacija, štipendija št. 14-15-00375.

Zahvala: avtorji se zahvaljujejo Andreju Alekseevu z Moskovske državne univerze Lomonosov za njegovo pomoč pri izvedbi eksperimenta. Naslov dopisovanja: Georgiy Vladimirov

Lomonosovskiy prospekt, d. 31, k. 5, Moskva, Rusija, 119192; [e-pošta zaščitena] Prejeto: 10. 3. 2016 Sprejeto: 18. 3. 2016

Prosti radikali, ki nastanejo v telesu, porušijo strukturo celičnih membran, kar posledično vodi v razvoj različnih patoloških stanj. Uničujoče oksidativne učinke radikalov preprečuje antioksidativni obrambni sistem telesa, v katerem imajo pomembno vlogo nizkomolekularne spojine – lovilci radikalov (pasti). Eden od virov antioksidantov so zdravilne rastlinske surovine, pa tudi zdravila na njihovi osnovi, katerih študija antioksidativnega potenciala pomaga povečati njihov preventivni in terapevtski učinek.

Glavne metode za določanje antioksidantov so obravnavane v delih, vendar definicija antioksidantov kot kemičnih spojin ne daje popolne slike o zaščitnih lastnostih preučevanega predmeta: določajo jih ne le količina določenega antioksidanta, ampak ampak tudi z dejavnostjo vsakega izmed njih. Antioksidativna aktivnost ali antioksidativna aktivnost, AOA, je konstanta hitrosti reakcije antioksidanta s prostim radikalom (kInH). S kemiluminiscenčno (CL) metodo je mogoče določiti skupno količino radikalov, ki vežejo antioksidante v vzorcu (total antioxidant capacity, TCA), pri uporabi metode matematičnega modeliranja kinetike CL pa tudi hitrost nastajanja in reakcije radikalov z antioksidanti, torej AOA.

Najpogostejša modifikacija kemiluminiscenčne metode za določanje skupne antioksidativne kapacitete temelji na uporabi luminola kot aktivatorja kemiluminiscence. Vzorec se postavi v kiveto kemiluminometra z dodatkom luminola, vodikovega peroksida in spojine, ki je sposobna tvoriti radikale kot rezultat spontane razgradnje (termolize), na primer 2,2"-azobis-(2-amidinopropan) dihidroklorida (ABAP). ):

V prisotnosti molekularnega kisika alkilni radikal R^ tvori peroksilni radikal ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Iz LH s tvorbo vmesnih snovi (luminol hidroperoksid in luminol endoperoksid) nastane v elektronsko vzbujenem stanju molekula končnega produkta oksidacije luminola aminoftalne kisline, ki oddaja foton. in posledično opazimo kemiluminiscenco. Intenzivnost CL je sorazmerna s hitrostjo produkcije fotonov, ta pa je sorazmerna s stacionarno koncentracijo LH v sistemu. Z interakcijo z radikali antioksidanti prekinejo opisano verigo transformacij in preprečijo nastanek fotona.

Spojine, dovzetne za termolizo, niso edini možni vir radikalov pri analizi antioksidativne sposobnosti vzorca s kemiluminiscenčno metodo. Alternative so hrenova peroksidaza-vodikov peroksid, hemin-vodikov peroksid, citokrom c-kardiolipin-vodikov peroksid itd. Reakcijska shema za oksidacijo luminola s peroksidazami je obravnavana v delu Cormier et al. .

Kinetične krivulje CL za te sisteme odražajo dve stopnji reakcije: stopnjo povečanja intenzivnosti CL in stopnjo platoja ali postopnega upadanja luminiscence, ko

Intenzivnost CL je konstantna ali pa se počasi zmanjšuje. Delo opisuje dva pristopa k merjenju celotne antioksidativne kapacitete, ki upoštevata to značilnost krivulj. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) temelji na merjenju latentne dobe CL t in se lahko uporablja za določanje antioksidantov, kot sta Trolox ali askorbinska kislina: zanje je značilna visoka konstanta hitrosti reakcije z radikali in jih je zato mogoče imenujemo močni antioksidanti. V latentnem obdobju pride do njihove popolne oksidacije. Metoda TAR (Total Antioxidant Reactivity) meri stopnjo dušenja kemiluminiscence q na platoju ali maksimumu kemiluminiscenčne krivulje:

kjer je I intenzivnost kemiluminiscence brez antioksidanta, 11 pa je intenzivnost CL v prisotnosti antioksidanta. Ta metoda se uporablja, če sistem vsebuje pretežno šibke antioksidante z nizkimi konstantami hitrosti interakcije z radikali - veliko nižjimi v primerjavi s konstanto luminola.

Učinek antioksidantov ni označen le z indikatorji t in c. Kot je razvidno iz del, je za učinek antioksidantov, kot je sečna kislina v sistemu hemin-H2O2-luminol ali tokoferol, rutin in kvercetin v sistemu citokrom c-kardiolipin-H2O2-luminol, značilna sprememba največje hitrosti povečanja CL (utx). Kot kažejo rezultati matematičnega modeliranja kinetike, so vrednosti konstant hitrosti interakcije teh antioksidantov z radikali blizu vrednosti konstante luminola, zato lahko takšne antioksidante imenujemo antioksidanti srednje moči.

DE = DE0 - DE,

kjer sta DE0 in DE5 svetlobni vsoti CL za določen čas? v kontrolnem oziroma testnem vzorcu. Čas mora zadostovati za oksidacijo vseh antioksidantov v sistemu, to je, da CL krivulja testnega vzorca doseže raven CL krivulje kontrolnega vzorca. Slednje predvideva, da morajo raziskovalci ne samo beležiti svetlobno vsoto sija, ampak tudi dovolj dolgo časa snemati kinetično krivuljo CL, kar pa ni vedno storjeno.

Ker so vsi merjeni parametri odvisni od naprave in merilnih pogojev, antioksidativni učinek snovi v proučevanem sistemu običajno primerjamo z delovanjem standardnega antioksidanta, na primer Troloxa.

Sistem hrenove peroksidaze-vodikovega peroksida so mnogi avtorji uporabili za analizo skupne antioksidativne sposobnosti rastlinskih materialov. Za oceno količine antioksidantov v vzorcih je bila uporabljena latentna doba CL (metoda TRAP), v raziskavah pa površina pod krivuljo razvoja CL. Vendar navedena dela ne dajejo jasne utemeljitve

izbira enega ali drugega parametra za oceno OAU.

Namen raziskave je bil ugotoviti, kako razmerje različnih vrst antioksidantov vpliva na TOA, in modificirati kemiluminiscenčno metodo na način, da bi lahko natančneje določali TOA v rastlinskih materialih. Za to smo si zadali več nalog. Najprej primerjajte kinetiko CL proučevanih predmetov s kinetiko standardnih antioksidantov treh vrst (močnih, srednjih in šibkih), da bi razumeli, katera vrsta antioksidantov ima glavni prispevek k OAU preučevanih predmetov. Drugič, izračunajte OAE preučevanih predmetov z merjenjem zmanjšanja svetlobne vsote CL pod vplivom teh predmetov v primerjavi z delovanjem antioksidanta, ki daje največji prispevek k OAE.

MATERIALI IN METODE

Predmet študije so bili industrijski vzorci gloga, jerebike in šipka, ki jih proizvaja JSC Krasnogorskleksredstva (Rusija), pa tudi plodovi malin, ki so jih avtorji zbrali v moskovski regiji v naravnih pogojih rasti in posušili pri temperaturi 60-80 ° C, dokler ne prenehajo izpuščati soka in deformacije ob pritisku.

Reagenti za analizo antioksidativne kapacitete s kemiluminiscenčno metodo so bili: KH2PO4, 20 mM puferska raztopina (pH 7,4); peroksidaza iz korenin hrena (aktivnost 112 enot/mg, M = 44.173,9), 1 mM vodna raztopina; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kisline, M = 177,11), 1 mM vodna raztopina; vodikov peroksid (H2O2, M = 34,01), 1 mM vodna raztopina; raztopine antioksidantov (askorbinska kislina, kvercetin, tokoferol). Vse reagente proizvaja Sigma Aldrich (ZDA).

Določitev celotne antioksidativne kapacitete je bila izvedena s snemanjem kemiluminiscence na kemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) s programsko opremo PowerGraph 3.3. Za določanje OAE v rastlinskem materialu uporabimo 40 μl luminola v koncentraciji 1 mM, 40 μl hrenove peroksidaze v koncentraciji 0,1 μM, od 10 do 50 μl prevretka ali poparka (odvisno od koncentracije) in fosfatni pufer v zahtevano količino vstavite v kiveto naprave, da skupni volumen vzorca doseže 1 ml. Kiveto smo namestili v napravo in CL posneli ob opazovanju signala ozadja. Po 48 s snemanja signala ozadja smo v kiveto dodali 100 μl H2O2 v koncentraciji 1 mM in snemanje CL nadaljevali 10 minut. Pripravljeni so bili štirje vzorci z različnimi koncentracijami vsakega rastlinskega predmeta. CL je bil zabeležen tudi za raztopine askorbinske kisline, kvercetina in tokoferola pri petih različnih koncentracijah za vsakega od antioksidantov. Nato je bila OAU vzorcev decokcij in poparkov preračunana na kvercetin.

dosegel plato, kar kaže na popolno uničenje antioksidantov v sistemu. Razredčitve proučevanih vzorcev in koncentracije raztopin standardnih antioksidantov (navedene v podnapisih k slikam) so bile izbrane tako, da so bile vse kinetične krivulje CL izmerjene pri enaki občutljivosti naprave.

Antioksidativno kapaciteto smo izračunali iz spremembe površine (AS) pod kinetično krivuljo kemiluminiscence (vsota svetlobe) ob dodatku snovi, ki vsebuje antioksidant. Da bi to naredili, smo izračunali S0 za sistem brez antioksidanta in od njega odšteli površino SS, ki označuje sistem, ki mu je bil dodan antioksidant. Vrednost AS je odvisna od občutljivosti kemiluminometra in merilnih pogojev. Razmerje AS/C ■ V (kjer je C koncentracija preučevanega biološkega materiala v kiveti, g/l, V pa prostornina kivete, l) izraža antioksidativno kapaciteto 1 g preučevanega materiala, t.j. , rastlinske surovine.

Na podoben način smo izračunali antioksidativno kapaciteto ASa raztopine standardnega antioksidanta, na primer kvercetina, ki smo ga dali v enak volumen reakcijske mešanice. Razmerje AS/CÄ ■ V (kjer je CA masna koncentracija antioksidanta v kiveti, g/l) izraža antioksidativno kapaciteto 1 g antioksidanta.

Za vsakega od standardnih antioksidantov je bil zabeležen signal iz raztopin različnih koncentracij, da se zagotovi, da so izračuni v linearnem razmerju in da so dobljeni rezultati ponovljivi. Dejansko je bila pridobljena linearna odvisnost (ASa = kA ■ CA) signala od koncentracije, iz katere je bil izračunan stehiometrični koeficient kA. Po Fisherjevem kriteriju so dobljene vrednosti kA za standardne antioksidante statistično značilne z verjetnostjo 0,975. Nato smo za vsakega od štirih rastlinskih vzorcev posneli signal štirih koncentracij in za vse vzorce dobili linearno odvisnost signala od koncentracije (AS = k ■ C), iz katere smo izračunali stehiometrični koeficient k. Z verjetnostjo 0,975 (Fisherjev test) so vrednosti k, dobljene za vzorce rastlin, statistično značilne. Skupno antioksidativno zmogljivost rastlinskega materiala glede na maso standardnega antioksidanta (mg%) smo ugotovili s formulo

OAE = k ■ 105. k

Vrednosti so bile predstavljene kot aritmetična sredina ± standardna deviacija (M ± 5) pri p<0,05.

REZULTATI RAZISKAVE

Študija kinetike kemiluminiscence v prisotnosti natrijevega askorbata (slika 1) je pokazala, da je za ta antioksidant značilno latentno obdobje, ko je CL skoraj popolnoma potlačen. Njegovo trajanje je sorazmerno s količino antioksidanta v sistemu. V tem primeru se ne spremeni niti naklon CL krivulj niti intenziteta CL na platoju. To je razloženo z dejstvom, da je askorbinska kislina močan antioksidant, ki prestreže vse radikale, ki nastanejo v sistemu, vključno z radikali luminola, in CL se ne razvije, dokler ni ves askorbat oksidiran.

Učinek tokoferola (slika 2) se je pokazal z zmanjšanjem intenzivnosti CL na platoju, kar je značilno za šibke antioksidante, čeprav tokoferol velja za enega najbolj

močni antioksidanti. Morda je to neskladje posledica dejstva, da so bili v našem eksperimentu prosti radikali v vodni raztopini, medtem ko se učinek tokoferola običajno preučuje v nepolarnem mediju. V študiji, kjer je bil vir radikalov kompleks citokroma c s kardiolipinom in je reakcija z luminolom potekala znotraj tega kompleksa, je imel tokoferol lastnosti srednje močnega antioksidanta.

Po preučevanju vpliva različnih koncentracij kvercetina na naš sistem (slika 3) in primerjavi kinetičnih krivulj zanj ter natrijevega askorbata in tokoferola lahko ugotovimo, da se glavni učinek kvercetina kaže v spremembi naklona krivulje, tj. hitrost razvoja CL, ki je značilna za srednje močne antioksidante.

Krivulje CL za vse preučevane decokcije (slika 4) so podobne krivuljam za kvercetin z rahlim zmanjšanjem intenzivnosti CL na koncu, tj.

Čas, min

riž. 1. Vpliv natrijevega askorbata na kinetiko kemiluminiscence

Koncentracije komponent sistema: luminol - 40 µM, hrenova peroksidaza - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM natrijevega askorbata.

planota. Kot je prikazano v delu, je to vedenje značilno za antioksidante srednje jakosti, ki v našem primeru vključujejo polifenole - flavonoide in tanine. Za poparek plodov maline (slika 4, D) je opazno zmanjšanje kemiluminiscence na ravni platoja, kar je značilno za šibke antioksidante, kar je v tem primeru tokoferol. Kar zadeva kvercetin in tokoferol, vsebuje malinov poparek 4,7 ± 0,9 µmol/g kvercetina in 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferola.

Pri primerjavi kemiluminiscenčnih krivulj, dobljenih za različne koncentracije štirih preučevanih vodnih izvlečkov iz rastlinskih materialov, se je pokazalo, da se je prispevek srednjih in šibkih antioksidantov k skupni antioksidativni kapaciteti vzorcev zmanjšal v naslednjih serijah: malinov poparek (slika 4). , D), decoction šipka (slika 4, B), decoction plodov rowan (slika 4, A), decoction plodov gloga (slika 4, B). Vrednosti AS glede na koncentracijo C preučevane snovi v kiveti in vrednosti skupne antioksidativne kapacitete glede na kvercetin so podane v tabeli.

RAZPRAVA REZULTATOV

Podatke, pridobljene med poskusi, in vrednosti OAE preučevanih predmetov, izračunane na njihovi podlagi, smo primerjali z vsebnostjo glavnih antioksidantov v njih, določenimi s kemičnimi analiznimi metodami. Kljub dejstvu, da je pozitivna korelacija med skupno količino antioksidantov in TAU v različnih objektih nesporna, še vedno obstajajo opazne razlike med temi indikatorji. Na primer, če vzamemo vsoto vsebnosti flavonoidov, taninov in askorbinske kisline, se izkaže, da je večja od izračunane TAU za vse proučevane predmete, razen za decokcijo plodov gloga (tabela).

Tudi drugi raziskovalci so pokazali, da se rezultati kemijske analize in vrednost TAU, določena s kemiluminiscenčno metodo, pogosto ne ujemajo. Med delovanjem je določena skupna antioksidativna kapaciteta

46 Čas, min

Jaz" "h chi----.

riž. 2. Vpliv tokoferola na kinetiko kemiluminiscence

Koncentracije komponent sistema: luminol - 40 µM, hrenova peroksidaza - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,01 µM; 3 - 0,025 µM; 4 - 0,06 µM; 5 - 0,1 µM; 6 - 0,2 µM tokoferola.

46 Čas, min

riž. 3. Vpliv kvercetina na kinetiko kemiluminiscence. Koncentracije komponent sistema: luminol - 40 µM, hrenova peroksidaza - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,02 µM; 3 - 0,03 µM; 4 - 0,04 µM; 5 - 0,05 µM; 6 - 0,06 µM kvercetina.

Čas, min

46 Čas, min

120 I 100 80\60 40 20

46 Čas, min

riž. 4. Vpliv decokcij plodov jerebike (A), gloga (B), šipka (C) in poparka plodov maline (D) na koncentracije kemiluminiscence komponent sistema: luminol - 40 µM, hrenova peroksidaza - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. (A) Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g / l decoction rowan sadja. (B) Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g / l decoction plodov gloga. (B) Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l prevretek šipka. (D) Krivulje: 1 - kontrolni vzorec; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l poparka plodov maline.

v sistemu peroksidaza-luminol-vodikov peroksid v korelaciji z vsebnostjo triterpenskih spojin. Vendar pa v delu istih avtorjev, v katerem je bila predmet študije druga rastlina, niso opazili korelacije OAE z vsebnostjo katere koli skupine snovi, vključno s flavonoidi.

Takšna odstopanja so povezana z najmanj tremi dejavniki. Prvič, pomembna je aktivnost antioksidantov, to je hitrost njihove interakcije z radikali, ki je različna za različne antioksidante, vključene v rastlinski vzorec. Po Izmailovu se konstante hitrosti ustreznih reakcij za meksidol, tokoferol in kvercetin ujemajo kot 0,04: 2: 60. Drugič, vsaka molekula antioksidanta, ki vstopi v kemično reakcijo, lahko prestreže različno število radikalov. Glede na delo so kvercetin, sečna in askorbinska kislina prestregle 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 oziroma 0,5 ± 0,2 radikala na reagirano molekulo antioksidanta (uporabljen je bil sistem hemin-H2O2-luminol). Tretjič, na rezultate študije bi lahko vplivala prisotnost aktivnosti peroksidaze v samih rastlinskih vzorcih, kot v delu, pa tudi prisotnost kalcija v vzorcih, ki je, kot je prikazano v delu, sposobna povečati aktivnost hrenove peroksidaze pod določenimi pogoji. To običajno vodi do več

večjo intenzivnost CL na platoju kot na kontrolnih krivuljah, česar pa nismo opazili.

Še pomembnejši je stehiometrični koeficient antioksidanta. Število radikalov n, ki jih prestreže, je enako

kjer je p stehiometrični koeficient, Am pa sprememba koncentracije antioksidanta v času merjenja, v našem primeru začetne koncentracije testirane snovi v testnem vzorcu.

Razlika v svetlobni vsoti luminiscence v odsotnosti antioksidanta in v njegovi prisotnosti je sorazmerna z n. Skupno število prestreženih radikalov je enako n = Y.p. m,

kjer je stehiometrični koeficient določenega antioksidanta, m pa njegova koncentracija med merjenjem

Predmet študije Flavonoidi, mg%* Tanini, mg%* Askorbinska kislina, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. enote TAU, mg% kvercetina

Odvretek plodov jerebike 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Prevretek šipka 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Prevretek plodov gloga 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Poparek posušenih plodov maline 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Opomba: * - literaturni podatki, . AS - sprememba svetlobne vsote za vzorec, rel. enote, C - koncentracija vzorca v kiveti, g/l. Izračunane vrednosti so zanesljive pri str<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rhenia. Skupno število prestreženih radikalov očitno ni enako skupni količini antioksidantov, saj koeficienti pt ne samo da niso enaki enoti, ampak se pri različnih antioksidantih tudi bistveno razlikujejo.

Vrednost n je sorazmerna z razliko v svetlobnih vsotah, izmerjenih v določenem času med vzorcem, ki vsebuje antioksidant, in kontrolnim vzorcem, ki ne vsebuje antioksidantov:

kjer je k koeficient, ki je konstanten pri enakih merilnih pogojih.

Pogoje za oceno celotne antioksidativne sposobnosti rastlinskih surovin smo izbrali s snemanjem kinetike kemiluminiscence v sistemu, ki ga sestavljajo hrenova peroksidaza, vodikov peroksid in luminol (koncentracije komponent - 4 nM, 100 µM oziroma 40 µM; 20 mM fosfat). pufer, pH 7,4 ),

zagotovila oksidacijo močnih antioksidantov (askorbinska kislina) in srednje močnih antioksidantov (kvercetin) v 10 minutah. To trajanje merjenja je priročno in zagotavlja zahtevano kakovost merjenja.

Literatura

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. Prosti radikali kot udeleženci v regulativnih in patoloških procesih. V: Grigoriev A.I., Vladimirov Yu.A., urednika. Temeljne vede – medicina. Biophys. med. tehn. M.: MAX Press; 2015. letnik 1. str. 38-71.

3. Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V. Metode preučevanja antioksidantov. Chem. rast. surovine. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Butovska D. I., Trofimov A. V. Antioksidativna aktivnost halkonov. Kemiluminiscenčno določanje reaktivnosti in kvantno kemijski izračun energij in struktur reagentov in intermediatov. Kinetika in kataliza. 2010; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Peroksi-

radikalno posredovana kemiluminiscenca: mehanistična raznolikost in osnove za antioksidativni test. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Vrednotenje antiradikalne zmogljivosti s H2O2-heminom inducirano luminolsko kemiluminiscenco. J Agric Food Chem. 3. december 2003; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu A., Proskurnina E. V. Prosti radikali in celična kemiluminiscenca. Uspekhi biol. kem. 2009; 49: 341-88.

10. Vladimirov Yu., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Kinetična kemiluminiscenca kot metoda za preučevanje reakcij prostih radikalov. Biofizika. 2011; 56 (6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. Določanje antioksidativne aktivnosti z merjenjem kinetike kemiluminiscence. Fotobiologija in fotomedicina. 2011; 7 (2): 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescenca, inducirana s termolizo 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropana). Brez

Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O uporabi dušenja luminiscence luminola za oceno aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. junij 1994; 16 (6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Vrednotenje celotnega antioksidativnega potenciala (TRAP) in skupne antioksidativne reaktivnosti iz meritev kemiluminiscence, okrepljene z luminolom. Free Radic Biol Med. februar 1995; 18 (2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Raziskava mehanizma luminiscentne peroksidacije luminola s tehnikami ustavljenega toka. J Biol Chem. 25. september 1968; 243 (18): 4706-14.

21. Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A. Določanje antioksidantov z aktivirano kemiluminiscenco z uporabo 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Vestn. MGU. Ser. 2. Chem 2012; 53 (3): 187-93.

24. Ministrstvo za zdravje ZSSR Državna farmakopeja ZSSR XI izd. vol. 2 »Splošne metode analize. Surovine zdravilnih rastlin." M .: Medicina; 1987. str. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Študija pripravkov za ekstrakcijo šipka. Farmacija. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Študija plodov gloga z uporabo različnih metod konzerviranja in vodne ekstrakcije. Farmacija. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. Biološko aktivne snovi sadja in vodnih ekstraktov navadne maline. Farmacija. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Študija biološko aktivnih snovi plodov gloga - surovin za pripravo homeopatskih matričnih tinktur. ob sob. znanstveni tr. po materialih XXIV Moskva. mednarodni homeopat. konf. “Razvoj homeopatske metode v sodobni medicini”; 24. in 25. januarja 2014; Moskva. M.; 2014. str. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Študija sestave biološko aktivnih snovi v zdravilnih rastlinskih surovinah različnih metod konzerviranja. ob sob. teze na podlagi gradiva XX Ross. nacionalni kongr. "Človek in zdravilo"; 15.-19. april 2013; Moskva. M.: EKOOnis; 2013. str. 184-90.

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Študija aktivnosti peroksidaze v ekstraktih iz korenin in korenin hrena in njegove stabilnosti na različne vplive. Vestn. Moskovska državna univerza. Ser. 2. Chem. 2006; 47 (5): 350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. V: Grigor"ev AI, Vladimirov YuA, uredniki. Fundamental"nye nauki - medicinitsine. Biofizične medicinske tehnologije. Moskva: MAKS Press; 2015.v. 1. str. 38-71. ruski.

2. Chanda S, Dave R. In vitro modeli za oceno antioksidativne aktivnosti in nekatere zdravilne rastline z antioksidativnimi lastnostmi: pregled. Afr J Microbiol Res. december 2009; 3 (13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal'tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel'nogo Syr'ja. 2004; (3): 63-75. Ruski.

4. Vasil"ev RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov in intermediatov. Kinetika in kataliza. 2010; 51 (4): 533-41. ruski.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioksidativni potencial spojin, povezanih s kurkuminom, preučen s kinetiko kemiluminiscence, učinkovitostjo prekinitve verige, čistilno aktivnostjo (ORAC) in izračuni DFT. Beilstein J Org Chem. 11. avgust 2015; 11: 1398-411.

6. Fedorova AV, Vasil'ev TL, Peroksi-radikalna kemiluminiscenca: mehanična raznolikost in osnove za analizo antioksidantov.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF. Enostaven kemiluminescenčni test za antioksidativne lastnosti rastlinskih lipidov: osnove in ilustrativni primeri. Analitik. 2009 oktober; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Vrednotenje antiradikalne zmogljivosti s H2O2-heminom induciranim luminolom

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Svobodnye radikaly i kletochnaya hemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49: 341-88. ruski.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya hemilyuminestsentsiya kak metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. Biofizika. 2011; 56 (6): 1081-90. ruski.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov method izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologija in fotomedicina. 2011; 7 (2): 70-6. ruski.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescenca luminola, inducirana s termolizo 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropana). Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O uporabi dušenja luminiscence luminola za oceno aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. junij 1994; 16 (6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Vidna kemiluminiscenca, povezana z reakcijo med methemoglobinom ali oksihemoglobinom z vodikovim peroksidom. Photochem Photobiol. 1994 nov; 60 (5): 405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro ocena antioksidativne aktivnosti liposomskih flavonolov s sistemom HRP-H2O2-luminol. J Mikroenkapsul. 2011; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Preiskava mehanizma

luminiscenčne peroksidacije luminola s tehnikami ustavljenega toka. J Biol Chem. 25. september 1968; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fitokemične lastnosti, aktivnosti odstranjevanja prostih radikalov in nevroprotekcija petih izvlečkov zdravilnih rastlin. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10. avgust.

19. Chang CL, Lin CS. Fitokemična sestava, antioksidativna aktivnost in nevroprotektivni učinek izvlečkov Terminalia chebula Retzius. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5. julij.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Vrednotenje antioksidativnega delovanja različnih flavonoidov s kemiluminiscenčno metodo. AAPS PharmSci. 2003; 5 (2): 111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi hemilyuminestsentsii s pol"zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Kemijski bilten Moskovske univerze. 2012; 53 (3): 187-93. ruski.

22. Pogačnik L, Ulrih NP. Uporaba optimiziranega kemiluminiscenčnega testa za določanje antioksidativne sposobnosti zeliščnih izvlečkov. Luminescenca. 2012 november-dec; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Skupni antioksidanti z nizko molekulsko maso kot sumarni parameter, kvantificiran v bioloških vzorcih s testom inhibicije kemiluminiscence. Nat Protoc. 2010 Sep; 5 (10): 1627-34.

24. Ministrstvo zdravohranenija SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11. izd. Izd. 2. "Obshchie metody analize."

Lekarstvennoe rastitel "noe syr"e". Moskva: Medltsina; 1987. str. 147-8. Ruski.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktionnykh preparatov shipovnika. Farmacija. 2012; (2): 14-6. ruski.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsiya. 2010; (5): 16-8. ruski.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsiya. 2014; (1): 8-10. ruski.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Zbornik 14. moskovske mednarodne homeopatske konference "Razvitie gomeopaticheskogo methoda v sovremennoi meditsine"; 2014 24-25 januar; Moskva M. ; 2014. str. 7. ruski .

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicalheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr"e razlichnykh sposobov konservatsii. Zbornik 20. ruskega nacionalnega kongresa "Čelovek in lekarstvo"; 2013, april 1519; Moskva. Moskva: EkOOnis; 2013. str. 184-90. ruski.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktah iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil "nosti k razlichnym vozdeistviyam. Chemistry Bulletin Moskovske univerze. 2006; 47 (5): 350-2. Ruski.